2.3.5 Вестерн-блот анализ

Вестерн-блот анализ по тестированию количества кальпастатина включал разделение тканевых белков (30 мкг на дорожку) методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии SDS (Laemmli, 1970) с последующим полусухим переносом полипептидов на нитроцеллюлозную мембрану (буфер: 48 мМ Трис-HCl, 39 мМ глицин, 0.0375% SDS, 20% метанол, pH 9.2). После инкубации (2 ч, 20°C) мембраны в буфере TBS (50 мМ Трис-HCl-буфер, 150 мМ NaCl, pH 7.5) проводили блокировку сайтов неспецифического связывания 5% раствором обезжиренного молока в буфере TBST (TBS с добавлением 0.1% Tween 20, pH 7.5) в течение 1 ч. Далее мембрану подвергали последовательному экспонированию с поликлональными антителами к кальпастатину (разведение 1 : 2500 в буфере TBST; 1 ч) и с антителами к IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой (разведение1 : 2000 в буфере TBST; 1 ч); каждый из указанных этапов завершался многократной отмывкой буфером TBST. Мембрану подвергали стандартной обработке системой Immune-Star (Bio-Rad, США).

2.3.6 Другие методы

Концентрацию белка во фракциях определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта.

Денситометрия полос на зимограммах и рентгеновской пленке проводилась с помощью стандартной программы “Image J”.

Статистическую обработку данных проводили с применением общепринятых методов вариационной статистики с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни), а также с использованием однофакторного дисперсионного анализа (Коросов, Горбач, 2007).

Глава 3.Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенерации на фоне эстрогенной терапии

Нейродегенерация индуцировалась у крыс линии Вистар старших возрастных групп – 12 и 24 месяцев. Экспериментальное воздействие заключалось в интрацеребральном введении 42-членного фрагмента амилоидного белка-предшественника – Абета(1-42) (экспериментальная модель болезни Альцгеймера), а также сочетанном интрацеребральном введениие бета-амилоидного пептида и интраназальном введении нейропротектора (эстрадиола). Среди животных были выделены: группа контроля – ложно-оперированные (2 μл физраствора в область правого гиппокампа); первая опытная группа – 2 μл раствора пептида Абета(1-42) (соответствуют 5μг пептида) в область правого гиппокампа; вторая опытная группа – после аналогичной инъекции пептида Абета(1-42) ежедневное интраназальное введение 0,1 мг 17-бета-эстрадиола.

Было обнаружено, что в присутствии амилоидогенного пептида в нервной ткани происходит активация кальпаиновой системы, причем степень активации положительно коррелирует с интенсивностью гибели клеток нервной ткани (плотностью нейронов). Регуляция кальпаинов может осуществляться как на уровне синтеза ферментного белка (или отдельных его форм – продуктов разных генов), так и на посттрансляционном уровне за счет процессов аутолиза, связывания с эндогенным ингибитором кальпастатином или с аллостерическим регулятором – кальцием.

Обнаруженное методом казеиновой зимографии увеличение пула аутолизированных кальпаинов (118 кДа) в группе животных №2 отражает активацию кальпаинов in vivo. Наблюдаемая активация m-кальпаина (120 кДа), по-видимому, как и во многих других ситуациях, сопряжена с избытком кальция в цитоплазме. Еще одним подтверждением этого пути регуляции активности кальпаинов служит стабильный уровень их ингибитора – кальпастатина, обнаруженный в нашем исследовании.

Как оказалось, терапия эстрадиолом обращает эффект гиперактивации кальпаинов, при этом снижается как общая активность кальпаинов в нервной ткани, так и активность индивидуальных фракций. В присутствии эстрадиола меньшая доля предшественника кальпаина подвергается аутолизу, а следовательно, активации. Необходимы дальнейшие исследования механизма регуляции активности кальпаинов у экспериментальных животных, в частности, необходимы эксперименты, направленные на установление источника избыточного кальция и поиск средств, предотвращающих эти патологические токи.

Уровень синтеза протеасом в мозговой ткани невысок в сравнении с другими органами и имеет тенденцию к снижению с возрастом (при сравнении показателей у 18, 24 и 30-месячных животных), о чем судили по количеству альфа-1,2,3,5,6,7 субъединиц протеасом, формирующих альфа-кольца коровой 20S частицы, универсальной для 20S и 26S протеасом.

Было подтверждено изменение уровня экспрессии и активности катепсинов в разных зонах мозга у экспериментальных животных. Интрацеребральное введение бета-амилоидного пептида привело в нашем эксперименте к значительному повышению (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Наши данные продемонстрировали значительное влияние бета-амилоида и эстрадиола на когнитивные функции крыс, оцененные с помощью водного лабиринта Морриса. У заранее обученных самок и самцов крыс после введения бета-амилоидного пептида в гиппокамп значительно (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Результаты конфокальной микроскопии срезов мозга показали, что введение бета-амилоидного пептида привело к значительному увеличению уровня его иммунореактивности в тканях как правого, так и левого (в меньшей степени) полушария головного мозга. Эти результаты, наряду с поведенческими данными, свидетельствуют об эффективности введенного препарата амилоидного пептида и служат доказательством репрезентативности выбранной модели болезни Альцгеймера. Последующее введение эстрадиола привело к снижению количества бета-амилоида в мозге крыс почти до контрольного уровня. Сокращение амилоидных депозитов у крыс, получавших эстрадиол, свидетельствует о запуске в нервной ткани неких адаптационных процессов, направленных на их утилизацию.

Механизм нейропротекторной роли эстрадиола пока полностью не понят, хотя отмечен этот феномен давно. Использование эстрадиола в качестве нейропротектора продиктовано несколькими причинами. Во-первых, нейропротективный эффект эстрадиола довольно хорошо известен и описан в литературе (McEwen et al., 2001; Asimiadou et al., 2005; Lebesgue et al., 2009). Во-вторых, показано, что эстрадиол в полном смысле слова является нейростероидом, так как в мозге имеются все ферменты, необходимые для его синтеза (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). В-третьих, известно, что нейропротективное действие эстрадиола связано с его антиоксидантным (Behl et al., 1997) и антиапоптотическим (Asimiadou et al., 2005) действием, то есть с эффектами, противоположными эффектам пептида Aбета.

Полученные результаты могут свидетельствовать об адаптивной реакции нервной ткани на введение токсичного пептида. В некоторых публикациях указывается на то, что система лизосомальной аутофагии может принимать участие в деградации бета-амилоидного пептида (Nixon, 2007). Вероятно, эстрадиол стимулирует аутофагию белкового материала; об этом свидетельствуют как данные о содержании пептида Aбета в мозговой ткани, так и оценка активности и уровня экспрессии протеиназ лизосом. Методом флюоресцентной иммуногистохимии было установлено снижение количества бета-пептида у крыс, получавших нейропротективную терапию эстрадиолом.

На основании данных, полученных в эксперименте можно сделать следующие выводы. 1. Уровень экспрессии генов лизосомальных протеиназ CtsD, CtsB, CtsL и альфа-субъединиц протеасом и активность кодируемых ими ферментов в коре головного мозга крыс при старении снижается. Напротив, активность кальпаинов у животных старших возрастных групп повышается. 2. Уровень экспрессии и активности катепсина D, а также интенсивность кальций-зависимого протеолиза значительно возрастают в гиппокампе и коре головного мозга крыс после интрацеребрального введения бета-амилоидного пептида, при этом страдает когнитивная функция животных. 3. Введение эстрадиола на фоне бета-амилоидной интоксикации приводит к уменьшению содержания этого пептида в гиппокампе крыс и улучшению биохимических и поведенческих показателей у экспериментальных животных. 4. Фармакологическая активация лизосомальной функции эстрогенами может способствовать удалению Aбета при болезни Альцгеймера; нормализация кальциевого гомеостаза в этой ситуации предотвращает патологическую активацию кальпаиновой системы, а, вместе с тем, и потерю нейронов по кальпаин-зависимым путям клеточной гибели.