66. Колоночная жидкостная хроматография

В колоночной жидкостной хроматографии сорбент находится в стекл.или метал.трубке (колонке). Используются сорбенты с диаметром частиц более 100 мкм. Колонка может иметь длину до нескольких метров. Элюент продвигается по колонке под действием силы тяжести. В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используются сорбенты, обладающие особыми свойствами (однородность частиц, ненабухаемость и т.д.). Диаметр частиц этих сорбентов не превышает 50 мкм.

Устройство жидкостного хроматографа

Подвижная фаза подаётся в колонку с пом. насоса. До попадания в насос подвижная фаза должна быть профильтрована и освобождена от растворённых в ней газов, так как пузырьки газа при попадании в колонку приводят к снижению её эф-ти. Ввод пробы в жидкостный хроматограф может проводиться с помощью петлевого дозатора.

Хроматографические колонки в ВЭЖХ, в отличие от газохроматографических колонок, прямые. Длина 10 - 30 см, внутр. диаметр 4 - 6 мм. Корпус колонки представляет собой цилиндр.трубку, изготовленную из стекла, нержавеющей стали .На верхнем и нижнем концах колонки расположены фильтры, представл. собой диски из пористой нержавеющей стали. Назначение фильтров – удерживание сорбента в колонке и задержка механических примесей.

Практическое применение

Высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения, в том числе и препаративного выделения, обнаружения и идентификации, а также количественного опр. вещ-в различной хим. природы .

Основные области применения ВЭЖХ в фармацевтическом анализе:

- идентификация лекарственных веществ, присутствующих в лекарственных формах;

- определение примесей в лекарственных веществах

-количественное опр. лекарственных вещ-в, входящих в состав лекарственных форм

- опр. лекарственных вещ-в в биолог. объектах

67.Эксклюзионная хроматография

В эксклюзионной хроматографии (гель-хроматографии) разделение основано на различиях в размерах и форме молекул. В качестве твёрдого носителя испол. разл. сетчатые полимеры («гели»). Неподвижной фазой является элюент, наход. в порах зёрен твёрдого носителя, подвижной фазой - этот же элюент, протекающий вдоль слоя частиц полимера.

В процессе хроматографирования более мелкие молекулы проникают в поры геля и задерживаются в находящейся в них неподвижной фазе. Более крупные молекулы не проникают в поры и поэтому движутся быстрее. Выход компонентов смеси из колонки происходит в порядке уменьшения их молекулярных масс . Величина коэффициента распределения (D) в эксклюзионной хроматографии может находиться в пределах от 0 до 1. Для крупных молекул D = 0,удерживаемый объём равен свободному объёму колонки -VR = Vm. В случае молекул, размер которых позволяет им свободно диффундировать через пористый материал, D = 1

Для эффективногоразделения в данном виде хроматографии приходится применять длинные колонки или несколько соединённых друг с другом колонок.

Твёрдые носители:

1.Мягкие- сефадексы, агранозные гели, полиакриламидные гели- орг. ВМС с небольшим кол-вом поперечных связей. Они гидрофильны. Обладают высокой эффективностью и прим. для разделения смесей низкомол.вещ-в.

Процесс хроматорафирования на мягких гелях называется гель-фильтрационной хроматографией.

2. Полужёсткие (сополимеры стирола дивинилбензола, поливинилацетатные гели).Гидрофобны.Их получают полимеризацией. Фактор емкости= 1.2-1.8

Процесс хроматографирования на таких гелях называется гель-проникающей хроматографией.

3.Жёсткие(силикагели и пористые стекла)- имеют фиксированный размер пор, кот. не изменяется ни при каких усл.бывают как гидрофильн., так и гидрофобными.

В качестве растворителей в эксклюзионной хроматографии используют воду, диметилформамид, хлороформ, толуол и т.д. Выбор растворителя зависит от типа используемого геля, вида разделяемых веществ, применяемой системы детектирования.

Основное назначение гель-хроматографии - разделение смесей высокомолекулярных соединений и определение молекулярно-массового распределения полимеров. Для отделения высокомол. вещ-в от низкомол. (белков от АК и низкомол. пептидов)чаще испол. гель-фильтрационная.

68. Масс-спектрометрия — метод исследования вещ-ва путём определения отношения массы к заряду и кол-ва заряженных частиц, обр.при том или ином процессе воздействия на вещество.

Масс-спектрометры-приборы для разделения ионизированных частиц вещества(молекул,атомов) по их массам, основанные на воздействии магнитных и электр.полей на пучкиионов, летящих ввакууме. В масс-спектрометрах регистрацияионовосуществляется электр. методами, в масс-спектрографах — по потемнению чувствительного слояфотопластинки, помещаемой в прибор.

  Масс-спектрометры имеют широкий динамический диапазон: от 5-6 порядков для анализа вещества орг.природы до 9-10 порядков для элементного анализа вещ-в.

Масс-спектрометр обычно сод. устройство для подготовки исследуемого вещ-ва; ионный источник, где этовеществочастично ионизуется и происходит формирование ионного пучка; масс-анализатор , в котором происходит разделениеионовпо массам, приёмникионов, где ионный ток преобразуется в электрический сигнал, который затем усиливается и регистрируется. В регистрирующее устройство, помимо информации о количестве, из анализатора поступает также информация о массеионов. Масс-спектрометр содержит также системы электрического питания и устройства, создающие и поддерживающие высокийвакуумв ионном источнике и анализаторе.

Масс-спектр - это зависимость интенсивности ионного тока от отношения массы к заряду. Каждый из пиков ионного тока соответствует однозарядным ионамизотопов. Отношение массы ионак ширине _m пика (в единицах массы) - разрешающая способность масс-спектрометра.

Различают статические (используются электрические и магнитные поля )и динамические(для разделения ионовс разными m/е используют разные времена пролётаионамиопр.расстояния) масс-спектрометры.

Хромато-масс-спектрометрия. Метод анализа смесей и определения следовых количеств веществ в объеме жидкости. Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов – хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго -идентификациюи определение строения вещества, количественный анализ.

Хромато-масс-спектометр включает три основные части: хроматограф (обычно газовый или жидкостный), масс-спектометр и интерфейс – специфический узел, обеспечивающий соединение и совместную работу хроматографических и масс-спектрометрических приборов.

Газовый поток из хроматографической колонки через первую форсунку со сверхзвуковой скоростью попадает в область вакуума, где молекулы распростр. со скоростями, обратно пропорциональными их массе. В результате более легкие и быстрые молекулы газа-носителя откачиваются насосом, а более медленные мол. орг. вещ-ва попадают в отверстие второй форсунки, а затем в ионный источник масс-спектрометра. Некоторые приборы снабжены двухстадийным мол. сепаратором, снабженным еще одним подобным блоком форсунок. В объеме между ними созд. высокий вакуум. Чем легче мол. газа-носителя, тем эффективнее они удал.из газ. потока и тем выше обогащение орг. вещ-вом. Наиб. удобный газ-носитель -гелий.