Определение этилового спирта
.pdfКонцентрация паров алкоголя в паро воздушной смеси от 100 до 1500 мкг/л. Погрешность составляет не более ± 5%.
Рис. 22. Генератор спиртовоздушных смесей «ГВС-МЕТА-02»
•
5. Химико-токсикологическое исследование биологических проб (кровь, моча, слюна)
на наличие алкоголя
Как указывалось выше, исследование биологических жидкостей на наличие и количественное определение этилового спирта прово дится только в случае тяжелого состояния пострадавшего, конфлик тных ситуаций и на основании личного заявления граждан.
Правила отбора
Результаты химического исследования биожидкостей на при сутствие этилового спирта во многом зависят от соблюдения мето дики их отбора, условий хранения, транспортировки и погрешности используемого метода.
Регламентация отбора биожидкостей с целью определения эти лового спирта приводится в методических указаниях «Химико-ток сикологический анализ веществ, вызывающих одурманивание», в Приказе МЗ РФ от 5 октября 1998 г. № 289 «Об аналитической диагностике наркотических средств, психотропных и других ток сических веществ в организме человека» и методических указаниях «Медицинское освидетельствование для установления факта упо требления алкоголя и состояния опьянения» от 1 сентября 1988 г. № 06-14/33-14 с изменениями, внесенными Приказом МЗ РФ от 12 августа 2003 г. № 399, в Приказе МЗСР РФ от 27.01.2006 г. № 40 «Об организации проведения химико-токсикологических исследо ваний при аналитической диагностике наличия в организме чело века алкоголя, наркотических средств, психотропных и других ток сических веществ».
81
Моча
Моча отбирается в чистый сухой стерильный пенициллиновый флакон «под пробку». Флакон закрывается стандартной резиновой пробкой, которую фиксируют алюминиевым колпачком.
Процедура отбора пробы мочи должна проводиться под наблю дением медицинского персонала для предупреждения замены или порчи пробы. При получении пробы мочи следует провести предва рительный анализ, который заключается в определении температу ры, рН, цвета, мутности.
Температура должна находиться в пределах 32,5—37,7 °С, рН мочи в норме должно быть в интервале 4—8, визуально проба должна выглядеть естественной.
Если результаты предварительного исследования вызывают по дозрение в фальсификации, персонал обязан провести повторную процедуру отбора пробы в условиях, исключающих фальсификацию.
При отсутствии возможности повторного отбора проводят хи мическое исследование имеющейся пробы мочи на присутствие креатинина и мочевины (19), которые составляют основную массу малорастворимых в ней азотсодержащих органических соедине ний (Кисин М. В. с соавт., 1973; Кисин М. В. с соавт., 1998). При отрицательном результате анализа исследование повторяется.
Методика. Часть жидкости концентрируют с помощью роторно го испарителя или нагреванием на водяной бане до получения ми нимального объема концентрата, и 2 мкл полученного концентрата наносят на хроматографическую пластинку с закрепленным слоем силикагеля или кремневой водной кислоты, а также на готовые хроматографические пластинки «Сорбфил». Параллельно на пластинку наносят 0,01%-й раствор креатинина и мочевины в физиологичес ком растворе или свежая кровь.
Хроматографирование осуществляют в системе н-бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:2). Длина пробега фронта растворителей 150 мм.
Обнаружение креатинина и мочевины проводится последова тельной обработкой высохшей пластинки двумя реактивами: йодом и п-диметиламинобензальдегидом.
После исчезновения запаха уксусной кислоты пластинку поме щают в герметичную камеру, на дно которой находится кристалли-
82
ческий йод. Через 4—5 минут на пластинке образуется пятно серова того цвета, переходящее в коричневый цвет с Rf = 0,25, соответству ющее по окраске и значению Rf креатинина.
После этого пластинку выдерживают на воздухе в течение 15—
20минут и опрыскивают раствором п-диметиламинобензальдегида. При наличии в исследуемой пробе мочи на хроматограмме наб
людается желтое пятно с Rf = 0,46, соответствующее по окраске и
значению Rf мочевине.
Приготовление раствора п-диметиламинобензальдегида (п-ДМБА). 1 г п-ДМБА растворяют в 30 мл воды очищенной. Полученный раствор добавляют к 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и добавляют до 100 мл воды очищенной, нагретой до 100 °С.
Слюна
Слюна отбирается в сухой стерильный флакон из-под пеницил лина в количестве 5 мл. Флакон закрывается стандартной резиновой пробкой, которую фиксируют алюминиевым колпачком.
Кровь
Перед отбором пробы крови в сухой стерильный флакон из-под пенициллина закапывают 1—2 капли гепарина или 0,8 мл 3,8%-го раствора цитрата натрия и встряхиванием флакона смачивают его внутреннюю поверхность.
Кровь в количестве 5 мл отбирается из поверхностной вены че рез иглу самотеком во флакон, обработанный гепарином или цитра том. Флакон закрывается стандартной резиновой пробкой, которую фиксируют алюминиевым колпачком. Содержимое флакона сразу же перемешивают.
Категорически запрещается обрабатывать кожные покровы в мес тах укола спиртом, диэтиловым эфиром, настойкой йода. Место укола следует обрабатывать раствором риванола (1 : 500) или раствором фурациллина (1 :5000).
У флаконов с отобранными пробами фиксируют резиновые проб ки алюминиевыми колпачками с помощью приспособления для обжи ма колпачков, обеспечивающего герметизацию флакона, и ставят их в холодильник. В случае герметизации другим способом флаконы долж ны быть опечатаны. На каждый флакон наклеивается этикетка с указа-
83
нием номера пробы, даты, времени забора пробы, фамилии освидетельствуемого, фамилии медицинского работника, подготовившего пробу.
В Приказе МЗ РФ № 289 указывается, что для отправки в хими ко-токсикологическую лабораторию биологическую жидкость от освидетельствуемого помещают в два флакона. Первый образец пред назначен для анализа, а второй — «контрольный образец», который ставится на хранение и используется для повторного анализа пробы в случае необходимости (при повторной экспертизе, по требованию правоохранительных органов, при необходимости использования более совершенных методов анализа и др.). К флаконам крепятся ярлыки с шестизначным кодом обследуемого и дату.
В лабораторию биопробы доставляются с направлением, в ко тором указываются порядковый номер пробы, наименование био жидкости, количество, дата, время взятия биопробы, цель анализа, фамилия, имя, отчества врача и организация, откуда поступило на правление с объектом исследования.
При доставке образцов проб в химико-токсикологическую ла бораторию производится наружный осмотр и устанавливается факт отсутствия нарушений в целостности упаковки. Контрольные образ цы хранят в запираемый и опечатываемый холодильный шкаф при температуре —18 "С. Срок хранения образца — 2 месяца со дня пос тупления в лабораторию. Если в течение этого срока отсутствовала необходимость в повторном химико-токсикологическом анализе, то по истечении 2 месяцев образец уничтожают.
Известно, что в крови человека содержится определенное коли чество этанола (эндогенный алкоголь).
Р. В. Кудрявцев с соавторами (1981) обследовали 115 доброволь цев, которые перед взятием крови не употребляли спиртных напит ков не менее 10 суток. При этом испытуемые не придерживались специальной диеты, получая обычное, нормальное питание.
Концентрацию этилового спирта в крови определяли газохроматографическим методом при непосредственном введении пробы биожидкости в хроматограф.
На основании экспериментальных данных, представленных на рис. 23 установлено, что у 87,9% обследованных добровольцев кон центрация эндогенного этанола составляла ниже 0,02%о.
84
Согласно литературным данным, физиологическое содержание этилового спирта в крови человека колеблется от 0,18 до 0,4%о. При этом надо понимать, что на результат количественного определения алкоголя в крови влияют многие факторы, в том числе — применяе мый метод, соблюдение методики отбора, условия хранения и транс портировки биожидкости, погрешность применяемого метода коли чественного определения и др.
50 -
45 -
АО - 35 30 25 20 15 10 5
а |
0.01 |
0, |
|
1 |
\— |
I |
I |
02 |
|
0,0i |
|||||
905 |
|
|
0,03 |
|
Рис. 23. Распределение концентрации эндогенного этанола в крови человека (Кудрявцев Р. В. и др., 1981; по оси абсцисс — концентрация эндогенного этанола в крови (в %с); по оси ординат — процент испытуемых)
В методических указаниях «Медицинское освидетельствование для установления факта употребления алкоголя и состояния опьянения» от 2 сентября 1988 г. № 06-14/33-14» в разделе «Методы количественного определения алкоголя в жидких биологических средах» указывается, что обнаружение алкоголя в биологической жидкости в концентрации 0,3%о не может достоверно свидетельствовать о факте употребления алкоголя.
Более того, о невозможности вынесения достоверного заключе ния об употреблении алкоголя при обнаружении алкоголя в биоло гической жидкости в концентрации ниже 0,2%о в связи с примене нием для количественного определения высокочувствительного газохроматографического метода указывает А. Г. Зеренин (2002).
Исследование биосред на наличие алкоголя должно проводится в течение 1 часа после получения биологических проб. Допускается хра нение пробы при условии асептического отбора при температуре 0 °С не более суток и при температуре не ниже —4 °С в течение 5 суток.
85
При длительном хранении биосред с нарушением температур ного режима хранения в них развиваются бродильные и гнилостные процессы, которые могут существенно исказить результаты количес твенного определения.
Интенсивность образования этанола в биологических объектах зависит от ряда факторов, в частности от наличия микрофлоры и уровня глюкозы.
Согласно экспериментальным данным, полученным Ф. А. Галицким (1985, 1995), при ряде физиологических и патологических состояний в процессе хранения образцов крови и мочи в течение 10 суток в комнатных условиях (+18 °С + 3 °С) происходит образова ние этанола. Автором приводятся следующие данные:
—при ишемической болезни сердца в 75% у больных в образцах мочи происходит образование этанола, максимальная концентрация которого составляла 8,75%о;
—у беременных, особенно во втором и третьем триместрах бе ременности, в 60% случаев максимальная концентрация этанола в моче достигала 2,76%о;
—у детей в 61 % образцов мочи наблюдали образование этанола в концентрации до 8,54%о;
—после воздействия экстремальных факторов образование эта нола в образцах мочи произошло в 60% в концентрации до 5,7%о;
—в крови образование этанола наблюдали в 28,2% в концентра ции не превышающей 0,5%о.
Указанное образование этилового спирта в крови и моче, по мне нию Ф. А. Галицкого, обусловлено гликемией и глюкозурией вследс твие значительных нарушений углеводного обмена при ишемичес кой болезни сердца, при беременности, у детей, улиц после воздейс твия экстремальных факторов.
Эти выводы отчасти подтверждаются результатами исследо ваний A. W. Jones et al. (1999) которые отмечают, что при хране нии проб мочи, содержащей глюкозу в концентрации 0,5% или 1% и инфицированной дрожжами Candida albicans при +22 °С в течение 2 дней, происходило новообразование этилового спирта
вконцентрации до 0,25 г/л. Через 8 дней содержание этанола в присутствии глюкозы 0,5% и 1,0% достигало 2,1 и 4,5 г/л. При
86
снижении температуры до 4 °С и при добавлении натрия фторида (в концентрации 1% или 2%) образование алкоголя не происхо дило.
Исследование крови, мочи и слюны
Обнаружение и количественное определение этилового спирта в биологических жидкостях в химико-токсикологических лаборато риях наркологических диспансеров проводится газохроматографическим методом по методике, утвержденной Министерством здра воохранения РФ.
Ниже приводится методика, разработанная А. А. Колдаевым и рекомендованная к использованию методическими указаниями Минздрава СССР от 1 сентября 1988 г. № 06-14/33-14 «Медицинское освидетельствование для установления факта употребления алкого ля и состояния опьянения» с изменениями, внесенными Приказом МЗ РФ от 12 августа 2003 г. № 399.
Обнаружение этилового спирта и его структурных аналогов — алифатических спиртов (метилового, пропиловых, бутиловых и амиловых) проводится не по нативной молекуле, а по их сложным эфирам с азотистой кислотой (алкилнитритам).
Исследование биожидкостей на присутствие этилового спирта алкилнитритным методом осуществляется на газовых хроматогра фах (ЛХМ-8 МД, ЛХМ-80, «Цвет-100, 102, 106, 162», MX, MXK и других), в комплектацию которых входит детектор по теплопровод ности — катарометр. Для разделения алкилнитритов применяется колонка стальная длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм, запол ненная 20% ПЭГ-1500 на ИНЗ-600, модифицированным серебром. Температура колонки, инжектора и детектора 60 "С. Скорость газаносителя гелия 24 мл/мин; запись хроматограмм производится на потенциометре КСП-4, скорость диаграммной ленты — 240 мм/час. Детектор-катарометр, ток моста детектора 100 ма.
Методика обнаружения этилового спирта в биологических пробах
Во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл 50%-го рас твора трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл следуемой пробы. Флакон закрывают стандартной резиновой пробкой и помещают в
87
герметически закрывающийся металлический контейнер для фикса ции пробки в горловине флакона.
Содержимое флакона перемешивают и во флакон через пробку шприцем вводят 0,35 мл 30%-го раствора нитрита натрия. Смесь энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставля ют на 1 минуту. Шприцем отбирают из флакона 0,5 мл газообразной пробы, которые тотчас вводят в хроматограф. Обнаружение этилнитрита, который образуется в результате реакций I и II, осуществляется по абсолютному времени удерживания.
NaNO, + CCLCOOH -> HNO, + CCLCOONa (I)
C2HsOH + HN02 -> C2H5ONO + H20 (II)
Этилнитрит
С помощью секундомера измеряют время удерживания (t^) от начала выхода пика несорбируемого компонента (смеси воздуха и оксидов азота) до максимума измеряемого пика.
Для идентификации пика(ов), наблюдаемого(ых) на хроматограмме, достаточно вычислить относительное время удерживания (t ) по формуле (4) и сравнить полученную величину с данными, представленными в табл. 8.
1 *
|
|
Таблица 8 |
|
Относительные времена удерживания алкилнитритов* |
|
|
|
|
№ |
Наименование алкилнитрита |
Относительное время удерживания (t^) |
|
|
|
1 |
Метилнитрит |
0,492 |
|
|
|
2 |
Этилнитрит |
0,776 |
|
|
|
3 |
Изопропилнитрит (tR)** |
1,000 |
|
|
|
4 |
Изобугилнитрит |
1,776 |
|
|
|
5 |
Изоамилнитрит |
3,791 |
|
|
|
*— при вышеуказанных условиях хроматографирования;
**— изопропиловый спирт — внутренний стандарт.
88
Количественное определение
Количественный анализ проводят по методу внутреннего стан дарта, используя для расчета отношение высот пика этанола к пику изопропанола (или н-пропанола).
Во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл 50%-го рас твора трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл изопропанола (внут ренний стандарт) и 0,5 мл исследуемой пробы. Флакон закрывают резиновой пробкой и помещают в герметично закрывающийся ме таллический контейнер для фиксации пробки в горловине флако на. Содержимое флакона перемешивают и во флакон через пробку шприцем вводят 0,35 мл 30%-го раствора нитрита натрия. Смесь энергично встряхивают и оставляют стоять 1 минуту. Шприцем от бирают из флакона 0,5 мл газообразной пробы, которую тотчас вво дят в хроматограф.
Для получения достоверных результатов проводят три параллель ных исследования.
Концентрацию этилового спирта определяют путем вычисления отношения высот пиков этилнитрита и изопропилнитрита (н-про- пилнитрита) с последующей интерполяцией из калибровочного гра фика (рис. 24) зависимости отношения высот пиков этилнитрита к высоте пика изопропилнитрита (или н-пропилнитрита), построен ному раздельно для крови, мочи и водных растворов.
При построении графиков используют стандартные растворы этилового спирта в крови и моче в концентрациях от 0,4 до 2,0%о и от0до4,0%о.
Стандартные растворы этилового спирта в крови и моче готовят из исходного 2%-го водного раствора этанола. Для приготовления стандартного раствора, содержащего 1,0%о этилового спирта, пипет кой отмеривают 2,5 мл 2%-го раствора спирта, количественно пере носят в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем доводят кровью или мочой до метки (при 20 °С); для приготовления 3,0%о-го раство ра берут 7,5 мл,адля4,0%о-гораствора— 10 мл 2%-го раствора спир та и смешивают в мерной колбе вместимостью 50 мл с кровью или мочой, как указано выше. Стандартные растворы хранят в склянках темного стекла с тщательно притертыми пробками при температуре +2 — +6 "С. Перед открыванием склянку необходимо тщательно
89