2.2. Организация и методы экспериментов в условиях in vitro

В качестве наркоза использовали 25% раствор уретана из расчета 1,2 г/кг массы животного, который вводился внутрибрюшинно. При выборе в качестве наркотического вещества уретана нами учитывались сроки действия наркоза, отсутствие влияний на деятельность сердечно-сосудистой системы крыс, используемых нами в качестве объекта исследований.

Показателями наступившего наркоза являлись: исчезновение мигательных движений век при легком раздражении внутреннего угла глазной щели, ровное дыхание, прекращение колебаний вибрисс.

2.3. Методика регистрации сократимости полосок миокарда

Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro изучали на полосках предсердий и желудочков. Определение реакции сократительной функции миокарда на действие агонистов проводили в трех последовательно возрастающих концентрациях на установке "PowerLab" ("ADInstruments") с датчиком силы "MLT 050/D" ("ADInstruments").

Схема установки.

Примечание: 1 – стимуляторУСП-1А; 2 – чашка Петри; 3 –канал 1; 4 – канал 2; 5 – ванночка для изолированных полосок миокарда 6 – аналогово-цифровой преобразователь; 7 – системный блок; 8 – монитор.

Рис.5. установка "PowerLab" ("ADInstruments")

Наркотизированную крысу фиксировали на специальном, освещенном операционном столе, затем вскрывали грудную клетку, сердце быстро извлекали и помещали в чашку Петри с оксигенированным рабочим раствором при подключенном стимуляторе "ЭСЛ-2". Затем из правого желудочка и предсердия при помощи специальных ножниц и пинцетов препарировали полоски. Длина полосок составляла 1,5-2 мм, ширина не превышала 1мм. Препарат фиксировали вертикально одним концом к датчику силы, другим — к точке опоры, затем каждый препарат погружали в отдельный резервуар объемом 10 мл, в который подавался рабочий раствор

Состав раствора Кребса (в г/л):

NaСl- 8 г;

KCl- 0,3г;

CaCl2- - 3 мл;

MgSO4 –0,5 мл;

NaH2PO4- 0,04 г;

Глюкоза – 2 г;

Trizma HCl- 2.4-3.9 г/л;

Trizma base- 0.25 г/л (Sigma).

Раствор постоянно аэрировали карбогеном 95% O2 и 5% CO2 pH=7.4

Рабочий раствор готовился в день проведения эксперимента. Определение рН проводили с помощью рН-метра-иономера ЭКСПЕРТ-001, с электродом ЭСК 10601/7. Для поддержания рН в пределах 7.3-7.4 в раствор добавляли основной и кислотный буферы Trizma ("Sigma"). Полоски стимулировались через платиновые электроды с частотой 6 и 10 стимулов для 14-, 21- и 56-, 100-суточных животных соответственно, длительностью 5 мс.

Запись кривой регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения "Chart 5.0"(рис.6.). После погружения препаратов в резервуары следовал "период приработки" в течение 40-60 мин, в ходе которой мышечным полоскам постепенно придавалось оптимальное натяжение (такая точка растяжения, после преодоления, которой начиналось снижение силы сокращения препарата). По окончании приработки 10 мин регистрировали исходные параметры сокращения, затем в течение 20 мин с добавлением в рабочий раствор агониста одной из концентраций. Агонисты Р2-рецепторов: АТФ, 2-метилтио-АТФ, β, γ-метиленАТФ добавляли в различных концентрациях и оценивали изменения сокращений полосок миокарда крыс. По окончании стимуляции агонистами препараты трехкратно отмывали рабочим раствором в течение 10 мин, затем регистрировали исходные показатели для каждой последующей дозы. Фармакологические вещества не добавлялись до тех пор, пока не происходила стабилизация изометрического сокращения. После этого в течение десяти минут записывали исходные параметры сокращения. Рассчитывали реакцию силы и длительности сокращения в ответ на действие агонистов в абсолютных значениях и в процентах от исходного. Исходные сокращения полосок миокарда принимали за 100%, относительно них рассчитывали влияние используемых фармакологических агентов.

Для определения модулирующего влияния 2-метилтио-АТФ на эффект карбахолина записывали влияние карбахолина в течении 20 мин, затем отмывали, записывали исходную сократимость в течении 10 мин, вновь добавляли карбахолин и на 10 мин добавляли 2-метилтио-АТФ. Также проводили эксперимент с обратной последовательностью подачи веществ, когда карбахолин добавляли на фоне действия 2-метилтио-АТФ.

При изучении совместного влияния изопротеренола и 2-метилтио-АТФ сначала регистрировали контрольное влияние изопротеренола в течение 30 мин. Затем, полоски промывали, записывали исходную сократимость и на 10 мин добавляли 2-метилтио-АТФ. Проводили регистрацию сократимости при обратной последовательности подачи веществ, когда на фоне действия 2-метилтио-АТФ добавляли изопротеренол.

Рассчитывали абсолютные значения силы в граммах и общую длительность изометрического сокращения полосок миокарда предсердий и желудочков в секундах, а также оценивали процент изменения на воздействие агониста от исходных показателей.

Исходные значения сокращения принимали за 100%.

Рис.6. Программное обеспечение "Chart 5.0".

Использовали следующие формулы:

F = Fмаксимум – (Fминимум1+Fминимум2)/2,

где F – сила сокращения в граммах, а Fмаксимум , Fминимум1, Fминимум2 – соответствующие точки, на кривой одиночного изометрического сокращения.

t=t минимум1+tмаксимум+tминимум2,

где t – время сокращения в секундах, а tмаксимум, tминимум1, tминимум2 – соответствующие точки.