4.1.4. Определение бактерий рода Proteus.

Исследуемый материал из различных разведений пищевого продукта высевают в конденсационную воду скошенного МПА (метод Шукевича). Посевы инкубируют 24 часа при 37 о С. Образование характерного ползучего роста на поверхности агара и наличие в мазках грамотрицательных подвижных палочек свидетельствуют о наличии протея.

4.1.5. Определение коагулазоположительных стафилококков.

Исследуемый пищевой продукт из различных разведений в количестве 1 см3 засевают в солевой бульон (6,5%) в соотношении 1:9. Инкубируют 24 часа при 37 оС. Далее делают высев на ЖСА или МСА (молочно-солевой агар). Инкубируют 24 часа при 37 оС и при комнатной температуре. Изучают характер роста микроорганизмов: отбирают пигментированные, S-формы колонии с зоной лецитовителазной активности или без нее, готовят из них мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют (грамположительные кокки в гроздьях). Выделяют чистую культуру микроорганизмов, изучают наличие плазмокоагулирующей активности. На присутствие стафилококков указывает наличие грамположительных кокков, образующих пигментированные колонии S-формы, дающих положительную реакцию в тесте плазмокоагуляции.

4.2. Микрофлора молока и молочных продуктов

В молоко сапрофитная и патогенная микрофлора может попадать с вымени коровы, с рук доярок или доильного аппарата, а также в результате неправильной обработки, транспортировки или хранения. С кожи человека и животного в молоко попадают стрептококки, стафилококки и B. cereus. От больных людей и носителей попадают возбудители кишечных инфекции и пищевых токсикоинфекций. От больных животных человеку передаются возбудители туберкулеза, дизентерии, бруцеллеза, сальмонеллеза, ящура, сибирской язвы, Q лихорадки, клещевого энцефалита и др..

В сыром молоке, сохраняемом при комнатной температуре и в покое, можно наблюдать пять фаз развития микроорганизмов:

1) Бактерицидная фаза. Бактерицидные факторы молока (иммуноглобулины, лизоцим, лактоферин) задерживают развитие бактерий. Длительность этой фазы колеблется от 2 до 36 часов. Видимых изменений молока в этой фазе не наблюдают.

2) Фаза смешанной микрофлоры. Продолжается приблизительно 12 часов или несколько дольше. В этой фазе в молоке размножаются микроорганизмы, случайно попавшие в него. Видимых изменений продукта не наблюдают.

3) Фаза молочнокислых бактерий. Некоторые авторы различают в ней стадии размножения молочнокислых стрептококков и молочнокислых палочек. В первой усиленно размножатся молочнокислые стрептококки, расщепляющие молочный сахар с образованием молочной кислоты, что изменяет реакцию среды и создаёт неблагоприятные условия для развития гнилостных и щелочеобразующих бактерий. Продолжается этот период 48 часов, затем из-за кислой реакции среды развитие молочнокислых стрептококков задерживается, а молочнокислые палочки продолжают размножаться, так как они более устойчивы к условиям кислой среды. Однако при значительном снижении рН среды молочнокислые палочки также погибают. Молоко в этой фазе свёртывается и превращается в «простоквашу».

4) Грибковая или дрожже-плесневая фаза. В этот период происходит размножение молочной плесени и дрожжей, усваивающие молочную кислоту, что повышает рН среды и создает условия для размножения гнилостных микробов. При этом простокваша «зацветает».

5) Гнилостная фаза. В молоке размножаются гнилостные аэробные и анаэробные бактерии, пептонизирующие казеиновый сгусток, масляно-кислые микроорганизмы и другие, полностью разрушающие молоко.

При санитарно-микробиологическом исследовании молока в соответствии с ГОСТом и Техническим регламентом определяют:

1. Содержание мезофильных аэробных и факультативно – анаэробных микроорганизмов (КМАФАМ). Количество МАФАМ выражают в КОЕ в одном см3 или одном г продуктов

2. Наличие БГКП

3. Наличие сальмонелл

4. Наличие стафилококков

5. Наличие листерий

6. Сортность молока (ставят пробу на редуктазу)

7. Ставят пробу на брожение

4.2.1 Определение содержания МАФАМ.

При исследовании пастеризованное молоко разводят стерильным физиологическим раствором в соотношениях 1:10; 1:100, 1:1000 и вносят по 1,0 см3 в чашку Петри и заливают расплавленным и остуженным МПА, перемешивают и инкубируют трое суток при 30 оС, затем подсчитывают число выросших колоний по формуле:

X = n10m

где Х - количество МАФАМ в 1 см3

n - количество колоний

m – степень разведения

Норматив. Количество МАФАМ для пастеризованного молока в потребительской таре должно быть не должно превышать 105 КОЕ/см3.

4.2.2. Определение БГКП.

Пастеризованное молоко разводят физиологическим раствором в соотношении 1:10; 1:100 и засевают по 1 см3 в 3 пробирки со средой Кесслера с поплавками: В 1 пробирку вносят 1 см3 цельного молока; во 2 пробирку — 1 см3 из разведения 1:10 и в 3-ю — 1 см3 из разведения1:100. Термостатируют 18-24 часа при 37 оС. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП. При наличии газообразовании отмечают, что БГКП в нем обнаружены.

Норматив. БГКП не должны обнаруживаться в 0,01 см3 пастеризованного молока.

4.2.3. Выявление сальмонелл.

По ГОСТу определения сальмонелл не проводят, но согласно СанПиН в 25 граммах продукта сальмонеллы должны отсутствовать. Поэтому выявление бактерий рода сальмонелл, необходимо проводить по ГОСТ Р 52814 – 2007. Пробы засевают на забуференную пептонную воду в соотношении 1:9. Инкубируют 24 часа при 37оС. Затем делают высев по 1 см3 в 2 среды обогащения: RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) и тетратионатный бульон либо селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана). Среду RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) инкубируют 41 оС-24 часа, а селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана 24 часа 37 оС. Через 24 часа делают пересев на среды: XLD (ксилоза-лизин декстрозный агар) и Эндо, Левина или Плоскирева. Термостатируют 24 часа при 37 оС и учитывают характер роста (сальмонеллы образуют на среде Эндо колонии S-формы бесцветные или розовые) и делают отсев на скошенный МПА. Пробирки инкубируют 24 часа 37 оС.

Через 24 часа ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле с поливалентными сальмонеллезными сыворотками А, В, С, D и Е. В случае положительной реакции ставят РА с групповыми сыворотками. Одновременно с РА материал засевают на среду Олькеницкого и изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород. После инкубации (24 часа 37 оС) отмечают характер роста микроорганизмов. Сальмонеллы подвижными, не расщепляют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу, образуют H2S и не образуют индол. У выделенной чистой культуры бактерий изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород.

Для определения серовара сальмонелл используют РА с моновалентными О- и Н- сальмонеллезными сыворотками.Обнаружение микроорганизмов, образующих характерные колонии на средах XLD и Эндо, имеющих характерные морфологические, биохимические и антигенные свойства, указывает на присутствие в исследуемом пищевом продукте сальмонелл.

Норматив. Сальмонеллы должны отсутствовать в 25 см3 молока.

4.2.4. Выявление Staphylococcus aureus.

Проводят в соответствии с ГОСТом 303447 – 97 «Молоко и молочные продукты».

Определение S. аureus в определенном объеме продукта с предварительным обогащением. Из ранее приготовленных разведений, используем ту массу, в которой по нормативному документу S. aureus должен отсутствовать. Например: в молоке пастеризованном в потребительской таре наличие S. aureus не допускается в 1,0 см3.

Для выявления S. aureus 1 см3 цельного продукта вносят в пробирки с солевым бульоном (1:10), инкубируют при 24 часа 37 оС. Через 24 часа отсевают на среду Бэйрд – Паркера (ЖСА, МСА). Инкубируют 24-48 часов при 37ооС, готовят мазки и отсевают характерные колонии на МПА. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС, а затем ставят пробу на плазмокоагулазу.

Наличие характерных морфологических, культурных свойств и положительной реакции плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в определенном объеме.

Норматив: золотистых стафилококков не должно быть в 1см3 пастеризованного молока в потребительской таре.

4.2.5. Определение листерий.

Исследование включает несколько этапов:

1-й этап. Для определения листерий подготовленную навеску продукта (25 г/см3) вносят в среду для первичного обогащения в количестве 225 мл (ПБЛ 1 — питательный бульон для листерий) и инкубируют 24 часа при 37 оС.

2-й этап. Затем 0,1 см3суспензии из молока пересевают в 10 см3 среду вторичного обогащения (ПБЛ 2) и инкубируют 48 часов при 37 оС.

3-й этап. Через 48 часов из пробирок независимо от наличия или отсутствия признаков роста отсевают 0,1 см3 на поверхность двух чашек с ПАЛ (РАLСАМ) агаром инкубируют 24-28 часов при 37 С.

Примечание: допустимо не проводить второй этап (этап вторичного обсеменения) при посеве с низким исходным уровнем микробной контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде первого этапа, т.е. переходить сразу к посеву на агаризованные среды.

4-й этап. Изучают характер роста: на среде PALCAM — через 24 часа листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм., иногда с черным центром. Через 48 часов их диаметр равен 1,0-2,0 мм.; колонии становятся зелеными с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая флора образует желтые колонии за счет ферментации маннита. Отобранные колонии (3-5) пересевают на МПА, дополненный 1% глюкозы. Посевы инкубируют посевы 24 часа при температуре 30 о С.

5-й этап. Включает:

а) микроскопию (грамположительные тонкие короткие палочки, спор не образуют).

б) определение каталазной активности (положительны)

в) определение подвижности посевом уколом на полужидкий агар PALCAM в 2 пробирки. Одну инкубируют при 25 оС, другую при 37 о С 48-72 часов. При 20-25 оС подвижны, характер роста напоминает зонтик; неподвижны при 35-37 оС.

г) определение способности восстанавливать нитраты.

д) определение ферментации углеводов. Проводят посев на пестрый ряд (не утилизируют маннит, ксилозу; утилизируют рамнозу с образование кислоты) при 37 о С в течении 7 дней.

е) Определение гемолитической активности на кровяном агаре (образует зону гемолиза вокруг колоний)

Норматив. Наличие листерии не допускаются в 25 г или см3 продукта.

4.2.6. Определение редуктазной активности.

Проводят при исследовании сырого молока. Метод основан на способности восстанавливать метиленовый голубой ферментами, выделяемыми микроорганизмами, присутствующими в молоке. По продолжительности изменения окраски оценивают бактериальную обсемененность сырого молока. Чем медленнее процесс, тем меньше микроорганизмов в молоке, тем лучше его качество.

4.2.7. Проба на брожение.

Применяют при определении пригодности молока для производства сыра. Метод основан на способности некоторых микроорганизмов, присутствующих в молоке, свертывать его. Чем медленнее происходит образование сгустка без выделения сыворотки и пузырьков газа, тем лучше качество молока.