Методика приготовления препаратов с прижизненной (витальной) окраской.

Для приготовления препарата дрожжей или бактерий с прижизненной (витальной) окраской клеток на предметное стекло наносят крупную каплю суспензии микроорганизмов (как для приготовления препарата «раздавленная капля») и в эту каплю вносят небольшую каплю метиленового голубого по Лефлеру или каплю фуксина Пфейфера. Затем петлей или пипеткой краску перемешивают с суспензией микроорганизмов, кладут на эту каплю покровное стекло и слегка его придавливают. Получают «раздавленную каплю» живых окрашенных микробов, которую микроскопируют так же, как и обычную «раздавленную каплю». В окрашенном виде клетки микробов видны более ясно и четко, чем в неокрашенном, при этом мертвые клетки окрашиваются быстро и хорошо, в результате нарушения клеточной мембраны а живые — плохо пропускают краску через мембрану.

Фиксированные окрашенные препараты

Для приготовления фиксированного препарата покровное стекло не используется. Из капли с внесенной культурой готовят мазок, равномерно размазывая ее петлей или краем покровного стекла на площади 2--4 см . Мазок просушивают на воздухе или слегка нагревая в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Нельзя перегревать мазок - клетки микроорганизмов могут де­формироваться! Хорошо приготовленный мазок должен после сушки выглядеть на предметном стекле как едва заметный налет.

Фиксация препарата. Высушенный препарат фиксируют.

Цель фиксации: 1) быстро убить микроорганизмы (при медленной гибели клеток синтезируются автолитические ферменты, приводящие к появлению артефактных структур), 2) обеспечить лучшее прилипание препарата к стеклу, предохранив его тем самым от смывания, 3) сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как у мертвых клеток нарушена целост­ность мембран, и, в результате, они прокрашиваются лучше живых.

Для исследования тонкого строения клетки обычно применяют фик­сацию различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наносят на мазок, или препарат погружают в фиксатор. Время фиксации зависит от природы используемого вещества. Например, для фиксации препаратов метиловым спиртом или ацетоном достаточно 5 минут, а вре­мя фиксирующего воздействия этилового спирта 15-20 минут. Широкое применение в качестве фиксаторов нашли альдегиды, особенно формаль­дегид и глутаровый альдегид. Для фиксации липидов используется четырехокись осмия (О5О4). После окончания химической фиксации препарат следует осторожно промыть водой.

При исследовании морфологии клеток наиболее часто использует­ся фиксация высокой температурой. Для этого предметное стекло захватывают металлическим пинцетом мазком вверх и три раза проводят че­рез пламя горелки в верхней его части. Приступать к окраске препарата можно через несколько минут, когда стекло с препаратом остынет.

Окраска препарата. Существуют позитивный и негативный спо­собы окраски препаратов. При позитивном способе окраски краситель проникает в клетки микроорганизмов, окрашивая их. При негативном контрастировании краситель заполняет пространство, окружающее клетки, в результате чего микроорганизмы выглядят как светлые части­цы на равномерно окрашенном поле. Для простого позитивного окра­шивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются анилиновыми красителями: фуксином, генцианвиолетом, метиленовым синим.

Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие на стенках кюветы, и наносят на стекло из пипетки рас­твор выбранного красителя таким образом, чтобы красителем был по­крыт весь мазок. Выдерживают 1-3 минуты, а затем осторожно промы­вают водой и высушивают, слегка промокая фильтровальной бумагой. Ни в коем случае нельзя тереть бумагой приготовленный препарат во избежание его повреждения.