- •Бийский технологический институт (филиал)
- •Краткий курс биотехнологии
- •1 Природа и многообразие биотехнологических процессов
- •1.1 Введение
- •История развития биотехнологических процессов
- •1.3 Микроорганизмы, используемые в биотехнологических процессах
- •2 Производство белков одноклеточных организмов
- •2.1 Целесообразность использования микроорганизмов для
- •Производства белка
- •2.2 Использование дрожжей
- •2.3 Использование бактерий
- •2.4 Использование водорослей
- •2.5 Использование микроскопических грибов
- •3 Методы генетического конструирования
- •In vivo
- •3.1 Регуляция метаболизма в микробной клетке
- •3.2 Мутагенез и методы выделения мутантов
- •3.3 Плазмиды и конъюгация у бактерий
- •3.4 Фаги и трансдукция
- •3.5 Гибридизация эукариотических организмов
- •3.6 Слияние протопластов или фузия клеток
- •4 Технология производства метаболитов
- •4.1 Классификация продуктов биотехнологических производств
- •4.2 Общая схема биотехнологического производства продуктов микробного синтеза
- •4.3 Биотехнология получения первичных метаболитов
- •4.3.1 Производство аминокислот
- •4.3.2 Производство витаминов
- •4.3.3 Производство органических кислот
- •4.4 Биотехнология получения вторичных метаболитов
- •4.4.1 Получение антибиотиков
- •4.4.2 Получение промышленно важных стероидов
- •5 Биоиндустрия ферментов
- •5.1 Область применения и источники ферментов
- •5.2 Выбор штамма и условий культивирования
- •5.3 Технология культивирования микроорганизмов – продуцентов ферментов и выделение ферментов
- •5.4 Инженерная энзимология и ее задачи
- •6 Методы генетического конструирования
- •In vitro
- •6.1 Биотехнология рекомбинантных днк
- •6.2 Конструирование рекомбинантных днк
- •6.3 Идентификация клеток-реципиентов, содержащих рекомбинантные гены
- •6.4 Экспрессия чужеродных генов
- •6.4.1 Клонирование в бактериях
- •6.4.2 Клонирование в дрожжах
- •6.4.3 Клонирование в клетках животных
- •6.5 Использование генетической инженерии в животноводстве
- •6.6 Генная инженерия растений
- •7 Основы клеточной инженерии растений
- •7.1 История предмета
- •7.2 Методы и условия культивирования изолированных тканей и клеток растений
- •7.3 Дедифференцировка на основе каллусогенеза
- •7.4 Типы культур клеток и тканей
- •7.5 Общая характеристика каллусных клеток
- •7.6 Морфогенез в каллусных тканях как проявление тотипотентности растительной клетки
- •7.6.1 Дифференцировка каллусных тканей
- •7.6.2 Гистогенез (образование тканей)
- •7.6.3 Органогенез
- •7.6.4 Соматический эмбриогенез
- •7.7 Изолированные протопласты, их получение, культивирование, применение
- •7.8 Клональное микроразмножение и оздоровление растений
- •8 Экологическая биотехнология
- •8.1 Получение биогаза
- •8.2 Производство биоэтанола
- •8.3 Очистка сточных вод
- •8.3.1 Методы очистки сточных вод
- •8.3.1.1 Механические методы
- •8.3.1.2 Химические методы
- •8.3.1.3 Физико-химические методы
- •8.3.1.4 Биологический метод
- •8.3.2 Отстой сточных вод и его использование
- •9 Контрольные вопросы
- •Список литературы
- •Содержание
- •Краткий курс биотехнологии
4.3.2 Производство витаминов
Витамины представляют собой группу незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Витамины не образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофные организмы.
Микробиологическим способом можно получить практически все известные витамины. Однако экономически более целесообразно получать витамины выделением из природных источников или с помощью химического синтеза. С помощью микроорганизмов целесообразно получать сложные по строению витамины: β-каротин (провитамин А), В2, В12 и предшественники витамина D.
Витамин В12 (цианокобаламин). В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в печени быка 1 мг/кг) для того, чтобы использовать этот источник для промышленных целей. Химический синтез очень сложен. Синтезировать витамин В12 способны уксуснокислые бактерии, грибы и пропионовокислые бактерии. Наибольшее промышленное значение имеют Рго-pionibacterium и Pseudomonas (P. denitrificans).
Концентрат витамина B12 предназначен для обогащения кормов животных. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином B12 используют пропионовокислые бактерии, как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке.
Витамин В2 (рибофлавин) можно в небольших количествах выделять из природного сырья. В наибольшем количестве он содержится в моркови и печени трески. Наиболее активными продуцентами витамина B2 являются дрожжеподобные грибы рода Eremothecium ashbyii, входящие в класс аскомицетов, а также бактерии Bacillus subtilis. Витамином В2 обогащают некоторые сорта белого хлеба, его используют для окраски пищевых продуктов в оранжево-желтый цвет.
Каротиноиды – это предшественники витамина А, среди которых наиболее активен β-каротин. В организме человека каротиноиды не синтезируются, поэтому должны поступать извне. В печени каротин превращается в витамин А. Продуцентами каротиноидов могут быть грибы и дрожжи. В промышленности β-каротин чаще всего получают с помощью микроскопического гриба рода Blakeslea trispora.
β-Каротин используют при изготовлении пищевых продуктов как краситель. Его применяют при изготовлении колбас с целью замены нитрита натрия и обеспечения высокой интенсивности и устойчивости цвета. Используют при производстве леденцов, пищевых паст, кексов и других кондитерских изделий. Во многих странах β-каротин применяют для подкрашивания сливочного масла. Кроме того, он обладает антиокислительными свойствами, которые используются для продления срока хранения продукта.
Витамин D2 промышленно синтезируют с помощью дрожжей Saccharomyces serevisiae. Витамин используется для лечения и профилактики рахита человека и животных.
4.3.3 Производство органических кислот
В настоящее время биотехнологическими способами получают в промышленных масштабах ряд органических кислот. Из них лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты получают лишь микробиологическим способом, молочную, салициловую и уксусную – как химическим, так и микробиологическим, яблочную – химическим и энзиматическим путем. Уксусную кислоту продуцируют Aсеtobacter и Gluconobacter, лимонную – Aspergillus niger, Aspergillus wentii, молочную – Lactobacillus delbrueckii.
В качестве сырья для получения пищевого уксуса используют виноградное вино, пивное сусло, мед, соки различных фруктов и ягод после спиртового брожения или водный раствор этилового спирта для получения белого уксуса. Кроме спирта среда содержит уксусную кислоту и минеральные соли, в состав которых входят азот, фосфор, сера, марганец, калий. Иногда добавляют источники витаминов в виде различных экстрактов. Спирт служит источником углерода и энергии для бактерий.
Уксусная кислота стала первым микробиологическим продуктом, полученным с помощью иммобилизованных клеток. Этот способ может быть непрерывным и периодическим. В течение длительного времени применяется адсорбирование уксуснокислых бактерий на древесной стружке, древесном угле, коксе и других субстратах, Пропуская раствор этанола через генераторы с иммобилизованными бактериями, получают 10…15%-ный раствор уксусной кислоты. При этом из 100 л безводного спирта теоретически должно быть получено 103 л уксусной кислоты. На практике выход уксуса из 100 л этанола редко превышает 90 л, что связано с переокислением и неполным окислением этанола бактериями, а также с его испарением.
Уксус, полученный при брожении, имеет приятные аромат и вкус, которые обусловливают побочные продукты брожения: сложные эфиры (этилацетат и другие), высшие спирты, органические кислоты.
В столовом уксусе содержится от 5 до 9 % уксусной кислоты. Уксус с концентрацией кислоты от 20 до 30 % получают путем вымораживания исходного раствора. Путем перегонки получают 70…80%-ную уксусную кислоту, называемую уксусной эссенцией. Ледяная уксусная кислота содержит от 98,0 до 99,8 % кислоты.
Уксусную кислоту или уксус широко используют в пищевой промышленности. Уксус, полученный микробиологическим путем (пищевая уксусная кислота, столовый уксус), различается по сортам в зависимости от характера сбраживаемого субстрата. Известен яблочный, виноградный, грушевый и другие сорта уксуса. Уксус также применяют для растворения органических красителей, при получении медикаментов, пластмасс и т.д.
Лимонная кислота широко распространена в природе, относительно много ее содержится в некоторых ягодах, фруктах, особенно в цитрусовых (в лимоне от 5 до 10 %), в листьях и стеблях некоторых растений.
Ранее лимонную кислоту выделяли в виде лимоннокислого кальция из продуктов переработки листьев хлопчатника, стеблей махорки, хвои ели и в значительных количествах из плодов лимонов. Однако это производство является крайне дорогим и небольшим по объему. Поэтому лимонная кислота была дефицитным и дорогим продуктом.
В настоящее время лимонная кислота по объему производства является одним из главных продуктов микробного синтеза, ее общий выпуск в разных странах достигает 400 тыс. тонн в год.
Для получения лимонной кислоты используют микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Ustina и др. В настоящее время основными продуцентами лимонной кислоты являются различные штаммы гриба Aspergillus niger.
Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и одновременном избыточном содержании источника углерода. В условиях лимитирования роста гриба недостатком железа и марганца после полного поглощения из среды дефицитного элемента он прекращает расти, однако продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в клетках гриба начинает накапливаться лимонная кислота, которая в дальнейшем выделяется в среду.
Посевной материал в виде спор (конидий) выращивают на мелассной среде поверхностным или глубинным способом.
Лимонную кислоту выделяют из культуральной жидкости в виде плохо растворимой соли – цитрата кальция, которая образуется при добавлении мела. Перевод лимонной кислоты в свободное состояние достигается при добавлении строго определенного количества серной кислоты:
Цитрат кальция + Н2SO4 = Цитрат + Гипс.
Гипс удаляют фильтрованием. Раствор лимонной кислоты осветляют активным углем, упаривают, кристаллизуют.
Лимонная кислота используется в кондитерской промышленности для подкисления карамели, пастилы, вафель, так как она хорошо подчеркивает фруктовый вкус. Данную органическую кислоту в целях подкисления добавляют в мороженое, пищевые концентраты, маргарин, некоторые сорта колбас и сыра.
Лимонную кислоту применяют для торможения образования меланоидинов в сгущенном молоке с сахаром, раствором ее промывают и дезодорируют жировое сырье, обрабатывают перед холодным хранением свежее мясо, рыбу, фрукты с целью стабилизации их цвета, вкуса и запаха. Соли лимонной кислоты используют для изготовления шампуней и других моющих средств, так как они стимулируют вспенивание и обеспечивают механическую устойчивость пен.
Молочная кислота с 1881 г. производится промышленным способом с помощью молочнокислых бактерий. Для промышленного изготовления молочной кислоты пригодны только гомоферментативные молочнокислые бактерии, образующие до 98 % молочной кислоты. Применяются штаммы Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus bulgaricus.
Молочнокислые бактерии преобразуют в молочную кислоту самые разные углеводы, поэтому для промышленного получения этой кислоты используют мелассу, молочную сыворотку, глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, осахаренный крахмал и пр.
Молочную кислоту в промышленных условиях получают методом анаэробной глубинной ферментации. Во время ферментации рН среды поддерживают, добавляя мел. Через 6…7 суток культивирования в среде остается от 0,5 до 0,1 % сахаров и от 11 до 14 % лактата кальция. Из 100 г сахаров получают от 80 до 90 г лактата кальция.
Осадок мела и коллоиды отделяют фильтрацией. Фильтрат упаривают, охлаждают и кристаллизуют. Кристаллы лактата отделяют центрифугированием. Молочную кислоту из лактата получают разложением серной кислотой. Реакция идет при температуре от 60 до 70 °С в соответствии с уравнением:
Молочную кислоту обрабатывают активированным углем, фильтруют и фасуют. Конечный продукт – в виде жидкого концентрата молочной кислоты.
Молочную кислоту применяют для приготовления джемов, в которых она способствует хорошей консистенции. Молочная кислота как регулятор рН, улучшитель вкуса применяется в производстве многих сыров, квашении капусты, в сухом концентрате кваса. В хлебобулочном производстве молочная кислота и лактаты увеличивают объем мякиша и улучшают корку хлеба при использовании муки низкого качества. Способность лактатов удерживать влагу применяют в производстве колбас, сыров, детского питания. Молочную кислоту также используют для ускорения получения молочно-белкового сгустка при производстве творога.