Бактерии

Borrelia burgdorferi

Borrelia burgdorferi – возбудитель лайм-боррелиоза, достаточно часто встречается в РБ. Первым симптомом этого заболевания является воспаление и покраснение места укуса клеща. В этом случае рекомендуется принять рифампицин и сделать соответствующие анализы. Боррелез лечится, но может иметь серьезные последствия для здоровья человека. В норме укус клеща не вызывает воспалительной реакции. Случаи заражения боррелиозом сейчас встречаются чаще, чем случаи заражения энцефалитом. Место укуса энцефалитного клеща никак не отличается от места укуса здорового клеща. Borrelia относится к спирохетам. К спирохетам также относятся возбудитель сифилиса (бледная трепонема – Treponema pallidum). Геномы Borrelia и Treponema pallidum имеют много общего. Основу геномов Borrelia и Treponema pallidum составляет 1 линейная хромосома размером около 1 млн нуклеотидных пар. Геном спирохет относительно небольшой и линейный. Как и у любого прокариотического организма у спирохет есть внехромосомные генетические элементы. При попытке культивировать дикие штаммы спирохет все внехромосомные элементы генома очень интенсивно утрачиваются за счет, поэтому представление об этих элементах генома спирохет весьма ограничено. Считается, что дикий штамм Borrelia burgdorferi имеет 2 – 3 десятка внехромосомных генетических элементов, смесь линейных и кольцевых репликонов, которые фактически представляют собой плазмиды различного размера. Эти плазмиды достаточно стабильно поддерживаются в природных штаммах, но при культивировании значительная часть их утрачивается. Однако в геномном проекте Borrelia burgdorferi удалось каким-то образом зафиксировать и секвенировать 17 репликонов помимо линейной хромосомы. Наличие этих репликонов, значительная часть которых является линейными, позволило установить, каким образом внехромосомные генетические элементы могут реплицироваться и что из себя представляют теломерные структуры данного организма. В тех случаях, когда теломеры были клонированы и секвенированы, стали известны структуры теломер. В двух случаях (на плазмидной и хромосомной теломерах ) было четко показано, что теломеры ковалентно замкнуты. При сравнении структур различных теломер оказывается, что есть достаточно консервативный теломерный повтор, 2 участка, которые сохраняются практически без изменений.

См. слайд содержание ГЦ-оснований в хромосоме Borrelia burgdorferi

Микроорганизмы-симбионты и патогенны

См. слайд функциональный репертуар эндосимбионтов

Букмера (эндосимбионт тлей) и …. (эндосимбионт мухи це-це). Эндосимбионт мухи це-це синтезирует досточно много различных кофакторов. У букмеры количество генов, которые отвечают за синтез коватров, примерно совпадает с таковым у E. coli. У букмеры много генов, отвечающих за синтез аминокислот. У эндосимбионта мухи це-це наблюдается дефицит генов, отвечающих за синтез аминокислот. Недостающие аминокислоты и витамины эндосимбионты должны получать от своего хозяина. Эндосимбионты снабжают хозяина в большом количестве другими классами метаболитов.

Эксперименты по секвенированию геномов различных патогенных организмов показали, что практически у любого бактериального патогена эукариотического организма есть система секреции III типа. Для бактериальных патогенов эукариотического организма необходимо наличие специальной системы, обеспечивающей направленное «впрыскивание» факторов вирулентности в эукариотическую клетку. Обычно такой системой является система секреции III типа и в очень редких случаях система секреции IV типа (у агробактерий).

Каким образом полные геномные последовательности продвинули ученых в понимании того, как функционируют данные системы секреции?

См. слайд организация генов систем секреции IIIа у фитопатогенных бактерий.

Эта схема показывает, как организованы соответствующие кластеры генов. Всегда гены системы секреции III типа располагается на острове патогенности в любой части генома. Гены системы секреции III типа необязательно находятся на хромосоме. У ризобий эти кластеры располагаются на мегаплазмиде (традиционное название, т. к. мегаплазмида фактически является второй хромосомой). Детальный анализ островов патогенности фитопатогенов показывает, что существует два типа островов патогенности. У эрвинии и псевдомонады имеется один кластер таких генов, а у Ralstonia и Xanthomonas есть совсем другая система. Хотя белки секреторного аппарата те же, сходство между ними минимальное, это сходство прослеживается очень отдаленно. Между Erwinia и Pseudomonas и между Ralstonia и Xanthomonas сходство очень высоко. Считается, что и системы одного подтипа работают приблизительно одинаковым способом, а между системами разного подтипа есть существенные различия в их регуляции. Основным регулятором у P. syringae и E. amylovora является альтернативный сигма-фактор, а у R. solanacearum X. Campestris (как и у иерсиний) – AraC-подобный активатор (смотри конспект лекций «Регуляция метаболизма» на стр. 152). Гены основных факторов вирулентности патогена подвержены той же регуляции, что и гены системы секреции (входят в состав одного регулона вместе с генами компонентов системы секреции). Гены основных факторов вирулентности патогенна входят в состав общего с генами системы секреции регулона даже в том случае, если данные гены располагаются за пределами островов патогенности.

См слайд глобальный подход к поиску факторов вирулентности у фитопатогенов.

По наличию надлежащей промоторной последовательности можно идентифитировать эти гены. В целом схема характеристики неизвестного генома на предмет наличия факторов вирулентности выглядит следующим образом. Самым надежным признаком, по котором можно идентифицировать фактор вирулентности, является наличие HrpL-зависимого промотора. Есть более специализированные программы, которые четко идентифицируют промотор. Такие программы просты и работают надежно. Стандартный скан генома псевдомонад находит около 30 промоторов, которые расположены за пределами Hrp-кластера. Дальнейшие исследования показали, что большая часть генов, которые располагаются за этими промоторами, действительно кодируют секретируемые через эту систему белки и эти белки необходимы для заражения растений. В данном случае может быть использован комбинаторный подход для поиска генов, которые имеют отношение к определенному физиологическому признаку, в данном случае к системе секреции III типа и вирулентности. Еще один фактор, который можно использовать, - это секреторный сигнал. Консенсуса по поводу того, что представляет из себя секреторный сигнал, не существует, но есть определенные признаки, которые характеризуют секреторный сигнал. На этом слайде показано начало нескольких белков, являющихся субстратами системы секреции III типа. У данных белков в пределах первых пятидесяти аминокислотных остатков наблюдается амфипатичность белковой последовательности, т. е. чередование гидрофобных (изолейцин, валин, лейцин) и гидрофильных остатков (серин и треонин, в основном серин). В начале таких белков должно содержаться очень много серина (до двадцати процентов от общего количества всех аминокислот, содержащихся в начале данной белковой последовательности и выше 10% (это является характерным признаком данных белков!) от общего количества аминокислот, входящих в состав целого белка). В пределах первых 12-ти аминокислотных остатков у белков, являющихся субстратами системы секреции III типа, не должно быть отрицательно заряженных аминокислотных остатков (на пример, аспарагина и глутамина). Третью и четвертую позицию в аминокислотной последовательности белков-субстратов системы секреции III типа практически всегда занимает гидрофобный аминокислотный остаток, впереди и после которого располагается заряженный либо полярный аминокислотный остаток. Если вышеперечисленные принципы применить ко всем белкам в протеоме, то оказывается, что не очень много белков соответствует этим критериям.

См. слайд факторы патогенности P. syringae.

Скрининг протеома P. syringae показал, что около 300 белков из почти 6000 белков, кодируемых геномом этого организма, являются субстратами системы секреции III типа. Таким образом, круг кандидатов на роль эффекторов существенно сужается. Кроме того, существует еще один фактор, который можно использовать. Так как речь идет о белках, которые должны поступать в эукариотическую клетку; то функции белков-субстратов системы секреции III типа должны быть сходны с таковыми у эукариотических белков. Такие белки должны функционировать в эукариотической клетке и скорее всего белки-субстраты системы секреции III типа ведут свое происхождение от каких-то эукариотических белков. Действительно показано, что, если этот протеом сканируется на высокое сходство с эукариотическими белками, то значительная часть гомологов эукариотических белков оказывается факторами вирулентности. У генов бактериальных белков, составляющих значительную часть гомологов эукариотических белков, есть HrpL-зависимый промотор. У значительной части гомологов эукариотических белков можно также обнаружить и секреторный сигнал. Существуют и экспериментальные методики, которые, опираясь на наличие геномной последовательности, позволяют еще и экспериментально выявить факторы вирулентности, имеющие отношение к системе секреции III типа. Более старый экспериментальный подход использует репортерную технологию, при которой осуществляется мутагенез всего генома минитранспозоном, встроенным в какой-то репортер, в данном случае в репортер доставки в эукариотическую клетку. Используемый в этой технологии репортер представляет собой Avr-белок без сигнальной последовательности, который вызывает реакцию гиперчувствительности у «несовместимого» растения. Вначале производится масштабный мутагенез всего генома. Затем различными клонами, в которые встроился транспозон и, возможно, «подстроил» репортер под какой-то клеточный промотор, заражаются растения. Далее осуществляются наблюдения за индукцией симптомов у зараженных растений, которая произойдет при доставке репортера в растительную клетку. Если репортер доставлен в растительную клетку, значит репортер «пришит» к какому-то гену, который кодирует сигнал транслокации в растении. Соответственно этот ген является фактором вирулентности. Такой скрининг позволил выявить несколько десятков новых эффекторов, которые было сложно идентифицировать, используя другие технологии.

Еще один подход, который позволяет экспериментально находить эффекторы системы секреции III типа с учетом нуклеотидной последовательности, - это микрочипы. Каким образом можно за счет ДНК микрочипов или более старой технологии, блоттинг РНК на крупных мембранах (не очень удобный метод) позволяет экспериментально находить эффекторы системы секреции III типа? Существует два подхода. Сначала можно очень четко выявить членов HrpL-зависимого регулона, сравнивая уровень транскриптов в клетках дикого типа, у которых HrpL инактивирован,или, используя клетки с повышенной экспрессией HrpL. Если мы видим, что какой-то ген практически не экспрессируется в штамме дикого типа, т. е. имеет низкий уровень экспрессии, нулевой уровень экспрессии при инактивации HrpL и, наоборот, повышенный уровень экспрессии, когда повышена экспрессия этого альтернативного сигиа-фактора; то данный ген не является членом HrpL-регулона. Перед геном может не быть ярко выраженного промотора, потому что регуляция может идти опосредованно, т. е. HrpL может обеспечить синтез определенного регулятора, осуществляющего в свою очередь контроль за геном, который может быть выявлен таким образом. Данный скрининг позволяет обнаружить уже больше эффекторов системы секреции III типа.

Второй подход к использованию микрочипов позволяет сравнивать уровень транскриптов у бактерий, которые растут в лабораторных условиях (стандартно – в полноценном питательном бульоне) и в среде, про которую известно, что она индуцирует систему секреции III типа (минимальная среда с лимитом по азоту, а еще лучше использовать не среду, а контакт с растением). Можно опрыскивать листья растений суспензией бактерий, но это сложно сделать. Обычно в минимальную среду просто добавляется какой-нибудь растительный экстракт либо кусочки листьев. Таким образом обеспечивается контакт патогена со своим хозяином. Можно определить уровень транскриптов в чисто в лабораторных условиях и при контакте с хозяином. Те транскрипты, которые индуцируются при контакте с хозяином или существенно репрессируются, имеют отношение к заражению. Таким образом после того, как геномная последовательность станет известна, можно достаточно быстро получить информацию о факторах вирулентности соответствующего организма. Подобные эксперименты проводились на R. solanacearum и X. Campestris. Данная методика позволяет очень быстро разобраться с тем, какие факторы вирулентности есть у исследуемого патогена как они могут регулироваться и как происходит взаимодействие данного патогена со своим хозяином.

См. слайд организация генома Ralstonia solanacearum.

На этом слайде изображен еще один бактериальный геном, геном R. solanacearum, которая является патогеном большинства пасленовых, у картофеля R. solanacearum вызывает бурую гниль, а у томатов – стеблевые гнили и закупорку сосудов. Геном R. solanacearum состоит из двух кольцевых репликонов, один из которых чисто традиционно называется хромосомой. Второй репликон назывется мегаплазмидой. Размер мегаплазмиды 2 млн нуклеотидных пар. Данная мегаплазмида оказывается крупнее хромосом у некоторых бактерий (например Haemophilus influenzae). Эту мегаплазмиду некорректно называть плазмидой, т. к. она жизненно важна для функционирования бактерии. В состав мегаплазмиды входит часть генов рекомбинации и репарации, Hrp-кластер и гены, кодирующие рибосомную РНК.

См. слайд детальная структура фрагмента генома Ralstonia.

На этом слайде изображена плазмида бактерии Pantoe agglomerans. Pantoe agglomerans – это вездесущая бактерия, которая раньше называлась Erwinia herbicola. Erwinia herbicola - эпифитная бактерия, обитающая на листьях растений. Считается, что Erwinia herbicola не является паразитом, а просто питается выделениями растения. Однако есть небольшая часть штаммов Erwinia herbicola, которые сейчас переклассифицированы как Pantoe agglomerans, способных вызывать заболевания у растений. Два основных ее подтипа вызывают корончатые галлы на корневой шейки или слишком обильное корнеобразование. Сходные симптомы наблюдаются и при заражении растений агробактериями. Оказывается, что по крайней мере в Израиле, где очень интенсивно изучался данный организм, значительная часть корончатых галлов (считалось, что они появляются при заражении растений агробактерияами) на самом деле вызваны Pantoe agglomerans.

См. слайд плазмида патогенности P.agglomerans pv gypsophila.

Оказывается, что у данного патогена присутствует достаточно крупная плазмида размером около 150 тысяч нуклеотидных пар, которая содержит систему секреции III типа. В этой плазмиде фактически располагается целый остров патогенности, в состав которого кроме системы секреции III типа входят Hrp-кластер, несколько генов эффекторов системы секреции III типа (белки, для которых показан транспорт в растительную клетку либо очень сильно предполагаются), гены биосинтеза ауксинов. В данной плазмиде содержатся фактически те же гены, что и в плазмидах агробактерий, которые необходимы для ракового перерождения клеток. Но в плазмиде у Pantoe agglomerans не содержатся гены биосинтеза опинов. Для превращение эпифитной бактерии в патогенную достаточно только переноса плазмиды. Но это все-таки небольшое преувеличение, поскольку плазмида должна немного адаптироваться к хозяину. Пока не показано не одной функции, связанной с развитием данного заболевания, которая располагается на хромосоме.

85