2. Картирование геномов.
Без хромосомных карт нормальный геномный проект сделать невозможно. Есть три основных подхода к картированию: генетическое, физическое и цитологическое. В основе всех методик генетического картирования лежит изменение (определение?) частоты рекомбинации между двумя маркерами. Несмотря на то, что это самый первый из придуманных подходов к картированию, он используется до сих пор. Сейчас в геномных проектах большее значение имеют методики физического картирования, в которых расстояние между локусами на хромосоме измеряется физическими методами. Генетическое картирование не позволяет измерить реальное расстояние между маркерами на хромосоме, физическое – позволяет. Классическое цитологическое картирование – это карты политенных хромосом дрозофилы, которые строились просто за счет прокрашивания хромосом слюнных желез. В дрозофильном геномном проекте карты политенных хромосом использовались.
В классическом представлении генетическое картирование использует гены в качестве локусов, причем в данном контексте под маркером подразумевается маркер, который имеет фенотипическое проявление. Естественно, что для любого организма не так много локусов, которые можно связать с определенным фенотипом, и даже из тех локусов, к которым какой-то фенотип привязан, не всеми можно пользоваться. Для стандартного эукариотического генома число локусов, которые имеют фенотипическое выражение и которые можно использовать в генетическом картировании, редко превышает пару тысяч – в этом недостаток классического генетического картирования в случае эукариот. Около 10% можно использовать. Необходимо было разработать альтернативные маркеры, которые можно было бы использовать вместо генов, и поэтому в последние несколько десятков лет появился целый набор бактериальных маркеров, которые можно «ковырять» в любом количестве и привязывать к любому месту хромосомы. Детектируются они в молекулярном виде. Три типа геномного полиморфизма, которые возможны и которые сейчас используются в качестве молекулярных маркеров:
- полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism);
- полиморфизм длин простых повторов (Simple Sequence Length Polymorphism);
- полиморфизм по одиночным нуклеотидам (Single Nucleotide Polymorphism).
Полиморфизм – это аллели конкретного участка ДНК. Как правило, это либо нуклеотидная замена, либо небольшая инсерция или делеция. Т.е. то же самое, что и в случае аллелей генов классических, характерно и для молекулярных маркеров. Они работают, когда в соответствующем месте генома есть различные аллели. Такие молекулярные маркеры можно использовать при картировании.
Самый простой вариант - использование длин рестрикционных фрагментов, с ним сталкиваемся каждый раз при проведении рестрикции плазмидной ДНК. На схеме показаны 2 варианта одного и того же локуса: один из них несет дополнительный рестрикционный сайт, второй – не несет. Это и есть полиморфизм. Как их можно регистрировать? Обрабатывается соответствующей рестриктазой геномная ДНК, если сайт присутствует, то у нас получается на 1 фрагмент больше, чем когда сайта нет. Классическое рестрикционное картирование: находите 2 полиморфных локуса и располагаете их друг относительно друга, и получается рестрикционная карта генома. Выясняете, в какой точке располагается рестрикционный сайт, потом сравниваете размеры фрагментов. Для небольшого участка это делать достаточно легко. Если плазмида около 10 т.н.п., это легко сделать, если около 30 – фактически невозможно. В случае геномного картирования получается, что рестриктазы режут гораздо чаще, чем надо бы, и получается очень много фрагментов, соотнести их друг с другом нереально. Поэтому используются различные модификации карти-рования, которые, как правило, связаны с тем, что прицельно выбирается какой-то фрагмент генома и рестрикция идет только в этом участке. Тогда это можно детектировать и проанализировать. Классический подход в работе с полиморфизмом – это гибридизация по Саузерну (это скорее для облегчения анализа рестрикционных фрагментов – например, если анализируются большие фрагменты ДНК, которые дают на форезе шлейф, тогда зонд может выделить на шлейфе соответствующие бэнды). Если у нас есть какой- то полиморфный локус, делается ДНК-зонд – фрагмент ДНК, который перекрывает этот локус. Затем выделяется геномная ДНК, режется полностью соответствующей рестриктазой. После рестрикции идет электрофорез и с агарозного геля фрагменты ДНК переносятся на мембрану капроновую, после чего гибридизуется с ДНК-зондом, и в тех местах, где гибридизация произошла, на радиоавтографе видны полоски. Если полиморфного локуса нет, то зонд будет гибридизоваться с одним фрагментом, если есть – с обоими. Методика длительная и трудоемкая, поэтому сейчас не используется. Сейчас гораздо чаще используется ПЦР, т.к. это проще, дешевле, быстрее и автоматизировано. Детекция полиморфизма с помощью ПЦР: принцип тот же. Нужно выделить локальный фрагмент вокруг полиморфного локуса. В случае ПЦР он выделяется при помощи праймера: один праймер слева, второй справа. Продукт ПЦР потом обрабатывается рестриктазой, если сайта нет, получается один фрагмент, если есть – 2.
Полиморфизм длин простых повторов (слайд). Их есть 2 типа: минисателлиты и микросателлиты. Микросателлиты – повтор 2 или 4 н.п. Это ошибки в работе ДНК-полимеразы. Когда есть участок, где много раз повторяется олигонуклеотид, есть вероятность проскальзывания ДНК-полимеразы. Она с определенной долей вероятности может диссоциировать с матрицей и присоединиться к соседнему повтору, при этом образуется петля. В результате при репликации будет либо на один повтор больше, либо на один меньше. Такое проскальзывание, когда уже есть несколько повторов, происходит с достаточно высокой вероятностью. Полиморфизм такого типа встречается достаточно часто. С минисателлитами (это повторы до 25 н.п.) не совсем понятно, каким образом они генерируются. Как очень маловероятная версия – так же проскальзывание. В геномах эукариот присутствуют и минисателлиты, и микросателлиты. Чаще используют микросателлиты. Детектировать их можно по-разному. Те же самые методики – и гибридизация, и ПЦР – удобны (смотрят по длинне фрагментов, амплифицируюя область с SSLP). Эти молекулярные методики позволяют работать с диплоидными геномами. Если геном гетерозиготен, то выявится присутствие обоих аллелей. Если правильно подобраны условия электрофореза (обычно полиакрил-амидный электрофорез), можно разделить фрагменты, которые даже на 1 нуклеотид различаются по размеру. Обычно различаются минимум на 2 а в случае минисателлитов – на несколько десятков нуклеотидных пар.
Полиморфизм по одиночным нуклеотидам. Детектировать его такими методами нельзя. Самым надежным методом детекции является секвенирование соответствующего участка ДНК.
До недавнего времени это было совершенно нереально. Первая методика основана на том, что вы знаете позицию полиморфного локуса и вы прицельно стараетесь детектировать известные аллели. Принцип детекции основан на гибридизации короткого олигонуклеотида, который перекрывает область. Если олигонуклеотид достаточно короткий и тщательно подобран, наличие одной неспаренной пары оснований может воспрепятствовать его гибридизации с матрицей. Гибридизация сильно зависит от условий, и можно подобрать жесткие условия, когда только 100%-комплементарный нуклеотид будет гибридизоваться. Но надо еще детектировать гибридизацию. Один из методов детекции связан с использованием флуоресцентной метки, пришитой на один конец такого олигонуклеотида, причем на второй конец этого олигонуклеотида пришит тушитель флуоресценции. Праймер сделан таким образом, что концы, которые прилегают к метке и тушителю флуоресценции, комплементарны друг другу. Это так называемый молекулярный бакен. Если олигонуклеотид гибридизуется, а гибридизоваться он будет в случае отсутствия полиморфного локуса, то флуорофор и гаситель будут разнесены в пространстве и при облучении светом соответствующей длины будет флуоресценция. Если гибридизации нет, то флуоресценции не будет. Этот метод пригоден для десятков, максимум сотен полиморфизмов, которые имеют подходящую последовательность.
Есть технология, которая позволяет детектировать тысячи и десятки тысяч таких полиморфизмов. Это так называемая технология ДНК-чипов, или микромассивов, как их по-другому называют. Это фрагменты ДНК, зафиксированные на стеклянной подложке, с которыми можно проводить гибридизацию. Как правило, на стеклянной подложке фиксируются немеченые фрагменты, но можно фиксировать и меченые. Есть два типа таких микрочипов,
а) один из них достаточно просто делается. На стеклянную подложку сначала наносятся микроскопические капельки, под каждый ген делаются зонды, какая-то часть гена амплифицируется, потом эти кусочки ДНК капаются на стеклянную подложку, специальным образом фиксируются, денатурируются и получается одноцепочечный зонд, который соответствует определенному гену.
б) В случае детекции полиморфизма по одиночным нуклеотидам используется другой вариант таких микрочипов, в которых зонд на стеклянной подложке фиксируется прямо в процессе его синтеза. Синтез идет по методу фотолитографии, суть которого заключается в том, что включение следующего нуклеотида в растущий олигонуклеотид контролируется получением предыдущего нуклеотида лазером. В синтезе олигонуклеотидов участвуют две группировки: донорная и акцепторная. Для того чтобы контролировать этот процесс, на каждом шагу амидные группы сначала активируются, что позволяет присоединить один нуклеотид, а с другой стороны группы блокируются, т.е. следующий уже не присоединится. Поэтому процесс идет циклически: добавили 1 нуклеотид, он может присоединиться только в одном месте, затем промываете, избыток удаляете, деблокируете концевую группировку, тогда может присоединиться следующий нуклеотид. Стандартные синтезаторы используют химические процессы блокировки/деблокировки, а можно это делать при помощи света. Компания …. разработала микрочипы, в которых деблокировка идет за счет облучения. В компьютер, который этот процесс контролирует, вносится программа, какая последовательность должна быть, и сначала первый нуклеотид фиксируется на подложке, а затем в соответствии с тем, какой нуклеотид должен быть присоединен, лазерный луч облучает какие-то определенные участки подложки. Там, где произошло облучение, деблокирована активная группа, затем подается нужный нуклеотид, и он будет присоединяться только там, где светил лазер. Потом отмываются неприсоединенные нуклеотиды. Таким образом можно синтезировать зонды из нескольких десятков нуклеотидов. За счет того, что все контролируется лазером, можно получить очень плотные чипы. На один чип помещают тысяч 400 таких олигонуклеотидов. Реальное число зондов, которое можно использовать, получается около 100 000, потому что каждый из них должен быть как минимум в 3-х повторностях, а лучше – в четырех. Плюс еще на каждый чип необходимо наносить негативный контроль (процентов 10 чипа). Такая технология используется для детекции полиморфизма. Хромосомную ДНК режут рестриктазой на мелкие куски и метят флуоресцентной меткой. Добавляется на зонд меченая ДНК и идет гибридизация в условиях, которые жестко подобраны под размер нуклеотидов. Если меченая ДНК гибридизовалась с соответствующим олигонуклеотидом, то флуоресцентную метку можно детектировать методом конфокальной микроскопии. Когда полиморфизм детектирован, есть подходы к локализации.
Как можно картировать маркеры? Способы:
Молекулярные маркеры точно так же, как и классические гены, можно картировать генетически. Точно так же вы ставите скрещивание и определяете частоту рекомбинации, но просто вы смотрите не на фенотип, а детектируете наличие соответствующего маркера у потомков, выделяя ДНК и ставя, допустим, ПЦР (детектируется наличие локуса). Различия при фенотипическом и при молекулярно-биологическом генетическом картировании имеются.
- При использовании молекулярных маркеров генетическое картирование получается чуть более трудоемким, но зато это можно делать быстрее. В классическом генетическом картировании нужно ждать F2 или делать анализирующее скрещивание (если родители чистые линии?).
- При использовании молекулярных маркеров все равно, какие гены рецессивные, какие доминантные, главное, чтобы они были разными у скрещиваемых организмов. В этом большое преимущество молекулярно-биологического картирования, поскольку возможны случаи кодоми-нантности, неполной доминантности, что будет значительно усложнять детекцию.
- Генетическое картирование проводить достаточно просто, но у него есть недостатки. Это ограниченная разрешающая способность. Только у модельных организмов можно достичь высокой разрешающей способности, да и то у E. coli – порядка 3 т.н.п., у дрозофилы и дрожжей – порядка 10 т.н.п.
- Вторая проблема – непрямое измерение расстояния между локусами. Возможны ошибки, которые связаны с аномалиями рекомбинации. В геноме любого организма есть горячие точки рекомбинации, есть локусы, в которых рекомбинация может быть заблокирована, в результате могут получаться в некоторых случаях неточные карты. По большей части это не проблема, но иногда локусы на генетических картах могут быть переставлены местами. При генетическом картировании с определенной вероятностью такие штуки происходят всегда. Физическое картирование тоже может давать ошибки, но генетическое картирование в этом плане менее точно. Поэтому генетическое картирование используется для модельных организмов, которых давно изучали генетически. Генетические карты внесли существенный вклад в геномные проекты, но, тем не менее, если сейчас генетической карты нет, ее уже никто и не строит, сейчас сразу делается физическая карта, потому что она считается в целом точнее и все равно потом нужна будет. На завершающих стадиях без физической карты будет сложно.
Есть масса методик физического картирования, но мы остановимся на трех. Наиболее старый вариант физического картирования – это рестрикционное картирование. Помимо него используются еще 2 методики. СТС-картирование – очень удобный подход, который осуществляет картирование параллельно с отбором клонов для последующего секвенирования. И такая методика, как флуоресцентная гибридизация на препаратах, она же FISH (in situ), – что-то среднее между физическим картированием и цитологическим. Потому что такая методика хороша, когда идет привязка к карте хромосомной, полученной методами цитологического окрашивания.