18.3. Препараты ферментов

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, содержащиеся во всех клетках живых организмов. Они катализируют биохимические реакции, которые без них протекали бы с неизмеримо малой скоростью.

Важнейшими свойствами ферментов являются эффективность катализа (позволяют увеличивать скорость реакций в 10¹⁰-10'² раз) и исключительная избирательность действия (каждый фермент катализирует, как правило, одну химическую реакцию). Как и все белки, ферменты являются высокомолекулярными соединениями, с молекулярной массой от 10 000 до 1000 000. Ферментные белки, обладая малостойкой структурой, весьма чувствительны к изменениям значения рН и температуры. Для каждого фермента существует оптимум значения рН, при котором скорость катализируемой реакции максимальна. Так, активность трипсина имеет оптимум при значении рН 7,8; панкреатической амилазы - при 6,4-7,2. Отклонение значения рН в ту пли иную сторону ведет к снижению скорости ферментативной реакции. Фер-менты_ь оптимальное действие которых находится в нейтральной или щелочной средах, полностью ипакти-вируются кислым содержимым желудка.

Оптимальное значение температуры для большинства ферментов - 20-40°С. Повышение температуры до 40-50°С, как правило, приводит к падению ферментативной активности, а иногда и к полной денатурации ферментов.

При производстве упзнмных препаратов наряду с применением высокоэффективных научно обоснованных способов получения особенно необходима высокая культура производства, строгое соблюдение режимов технологии. Большое внимание уделяется стабилизации ферментов как на стадии получения субстанции, так и в лекарственной форме. В настоящее время используют три основных приема стабилизации: защита лабильных центров ферментов, ответственных за их активность, химической модификацией (в том числе иммобилизацией); защита от воздействия инактивирующих факторов нанесением оболочки и введением в субстанцию или лекарственную форму добавок, ипгнбирующих деструкцию ферментов.

Источником получения ферментов являются органы ч ткани животных, решительное сырье и ферменты, продуцируемые микроорганизмами. Основное количество ферментных препаратов медицинского назначения получают из органов и тканей животных. Из ферментов растительного происхождения в нашей стране для медицинских целей предложен к использованию только одни препарат: липаза из семян чернушки дамасской (Nigella Damascena L.J. Все шире используются в медицинской практике ферменты, получаемые из культур микроорганизмов, преимуществом которых являются более высокая доступность и экопо мичноегь их производства.

Препараты ферментов слизистой оболочки желудка. Пепсин (Pepsinum) - препарат, содержащий протеолитический фермент. Сырьем для получения пепсина служит слизистая оболочка желудка свиней, где он образуется в виде профермента - пепсиноге-на. Пепсиноген активируется кислотой хлороводородной и аутокаталитически, г. е. с помощью образовавшихся молекул пепсина. При этом от пепсиногена (м.м. 40000) сначала отщепляется остаточный полипептид, а затем ингибитор пепсина. Образуется активный пепсин (м.м. 34 000). Пепсин относится к карбо-протеиназам, содержащим остатки аминокислот ди-карбоповых в активном центре, с оптимумом значения рН 1,5-2,5.

При выделении протеолитического фермента основной задачей является получение (с высоким выходом) его в активной форме. Поэтому экстракцию сочетают с автолизом. Измельченные ткани заливают водой, подкисленной кислотой хлороводородной до значения рН 1,9-2,3. Соотношение сырья и экстрагента 10:1. Настаивание проводят при температуре около 40°С, перемешивая на протяжении 8 ч и повторно в течение 24 ч. Лизаты сливают, отделяют от верхнего слоя жира, объединяют, процеживают. Ферментную массу выделяют высаливанием, для чего к лизату (значение рН 1,9-2,3) при непрерывном перемешивании добавляют 20-25% раствор натрия хлорида. Пепсин, выделившийся из раствора, всплывает на поверхность. Его отделяют, сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 35-40°С, измельчают в фарфоровой шаровой мельнице и просеивают.

Стандартизуют препарат по протеолитической активности (переваривание белка куриного яйца): 10 г протертого белка в присутствии 0,1 г препарата в стандартных условиях должны полностью раствориться через 3-4 ч, образуя опалесцирующий раствор. После определения биологической активности препарат смешивают с сахарной пудрой. Он представляет собой слегка желтоватый порошок, сладкого вкуса со слабым своеобразным запахом. Хранят в хорошо укупоренных банках в прохладном (2-15°С), защищенном от света месте. Применяют при расстройствах пищеварения (гипо- и анацидный гастрит, ахилия, диспепсия). Назначают внутрь в виде раствора в комбинации с ацидином (бетаина гидрохлорид).

Ацидин-пепсин (Acidin-pepsinuvn) выпускают в таблетках по 0,5 и 0,25 г, содержащих I часть пепсина и 4 части бетаина гидрохлорида. При введении в желудок бетаина гидрохлорид легко гидролизуется с выделением свободной кислоты хлороводородной.

Абомин (Abominum) - препарат, содержащий сумму протеолитических ферментов, получают из слизистой оболочки желудка телят и ягнят молочного возраста. Он представляет собой аморфный порошок со специфическим запахом, соленого вкуса (содержит примесь натрия хлорида). Выпускают в форме таблеток по 0,2 г, с содержанием в 1 таблетке 50 000 ЕД.

Сок желудочный натуральный (Succus gastricus naturalis) получают по методу, предложенному И. П. Павловым, через фистулу желудка при мнимом кормлении собак или других животных (лошадей). Препарат представляет собой прозрачную бесцветную жидкость кислого вкуса, консервированную кислотой салициловой (0,03-0,04%). Он содержит все ферменты желудочного сока, 0,45-0,51% свободной кислоты хлороводородной, значение рН 0,8-1,2. Выпускают во флаконах по 100 мл. Хранят в защищенном от света месте, при температуре от 2 до 10°С. Применяют при недостаточной функции желез желудка.

Препарат ферментов поджелудочной железы. Панкреатин (Pancreatinum) - препарат содержит ферменты поджелудочной железы, главным образом трипсин и амилазу и в незначительном количестве липазу. Сырьем для получения панкреатина служит поджелудочная железа свиней или рогатого скота.

В поджелудочной железе протеолитические ферменты образуются в виде проферментов: трнпсино-гена, химотрипсиногена. Активирование этих ферментов происходит гидролизом того фрагмента их полипептидной цепи, который маскирует активный центр протеиназ. При получении панкреатина активирование проферментов поджелудочной железы осуществляют в экстракте в щелочной среде, в присутствии ионов кальция и с затравкой (панкреатин).

Ткани поджелудочной железы убойных животных измельчают на волчках и заливают водой, подкисленной кислотой уксусной - ледяной 5 мл на 1 л воды. Настаивание проводят в реакторе с мешалкой в течение 4 ч при температуре 10°С. Экстракт отделяюг центрифугированием или процеживанием с последующим прессованием остатка. Для активирования проферментов в экстракте создают среду со значением рН 8,1; добавляют кальция хлорид, чтобы приготовить 0,05 М раствор, и затравку - панкреатин. Настаивают 24 ч при температуре 5°С. Затем экстракт подкисляют до значения рН 6,0, и в изоэлектри-ческой точке осаждают балластные белки. Осадок отделяют, обезжиривают ацетоном и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 40 ^СС. Измельчают в фарфоровой мельнице.

Стандартизуют панкреатин по протеолитической активности - способности переваривать белок казеин в слабощелочной среде. Панкреатин должен содержать в 1 г 25-33 ЕД. Препарат выпускают в порошке и таблетках, покрытых оболочками, растворимыми в кишечнике. Хранят в хорошо закупоренных банках, в сухом, прохладном месте. Применяют при хронических панкреатитах с недостаточной функцией поджелудочной железы.

Технология ферментных препаратов из поджелудочной железы крупного рогатого скота: дезоксири-бонуклеазы (ДНКаза), рибонуклеазы (РНКаза), трипсина, химотрнпсина, ингибитора протеаз - пан-трипина и инсулина - разработана лабораторией органопрепаратов Всесоюзного научно-исследовательского института мясной промышленности. Принцип производства заключается в том, что измельченную поджелудочную железу подвергают автолизу, для чего смешивают ее с половинным количеством воды и оставляют на 18 ч при температуре 12°С. Затем в реакторе с мешалкой проводят экстракцию методом бнс-мацерации водой, подкисленной кислотой ортофос-форной до значения рН 2,0-*-2,5, при температуре не выше 5°С. Первая мацерация проводится с двойным количеством воды в течение 16 ч, вторая - с однократным 1 ч. Экстракты отделяют от жмыха центрифугированием и объединяют. Жмых используют для получения инсулина, а из экстракта высаливают ферменты различными концентрациями аммония сульфата (ДНКазу и РНКазу], добавляя кристаллический аммония сульфат до определенной степени насыщения при перемешивании и охлаждении. Фильтрат используют для получения химотрипсина, трипсина и пачтрипина.

Высол растворяют в воде (1:4) и в водном растворе осаждают балластные вещества добавлением аммония сульфата. Осадок отбрасывают, а к фильтрату добавляют 5 и. раствор натрия гидроксида до значения рН 4,5 и высаливают ДНКазу, медленно добавляя насыщенный раствор аммония сульфата до степени насыщения 0,4. Осадок ДНКазы отделяют и подвергают дальнейшей очистке. Из фильтрата осаждают РНКазу высаливанием аммония сульфатом до степени насыщения 0,8. Высол, содержащий аморфную РНКазу, отстаивают при 4-5°С в течение 40- 48 ч, жидкость сифонируют, а осадок отделяют на нутч-фильтре или центрифугированием. Полученную РНКазу очищают. Из фильтрата, содержащего комплекс ферментов, аммония сульфатом при степени насыщения 0,7 высаливают химотрипсин, трипсин и пан-трипин.

Из смеси ферментов получают неактивный химо-трипсиноген. Для этого осадок растворяют в воде, подкисленной кислотой серной до значения рН 3,0, при температуре не выше 5°С и медленно добавляют при перемешивании раствор аммония сульфата. Затем раствор подщелачивают 5 и. раствором натрия гидроксида до значения рН 5,0 и выдерживают при комнатной температуре до полного осаждения кристаллического химотрипсиногеиа.

Из фильтрата и промывных вод, полученных после отделения химотрипсиногеиа, выделяют трипсиноген высаливанием аммония сульфатом при лодкислении 5 н. кислотой серной до значения рН 3,0.

Фильтрат, оставшийся после выделения трипсина, подкисляют кислотой хлороводородной до значения рН 2,5 при температуре 5°С. Из подкисленного фильтрата добавлением кристаллического магния сульфата высаливают пантрипин совместно с балластными белками. Последние удаляют коагуляцией при нагревании раствора до температуры 90°С в течение I мин и быстром охлаждении до температуры 20- 25°С. Осадок балластных веществ отделяют фильтрованием. К фильтрату, объединенному с промывными водами, медленно при перемешивании добавляют кристаллический аммония сульфат и отстаивают в течение 12 ч при комнатной температуре. В результате образуется два осадка: аморфный и кристаллический. Темный аморфный осадок пантрипина отделяют от белого кристаллического осадка балластных веществ. Осадок пантрипина растворяют в воде и диализируют. По окончании диализа раствор фильтруют, стандартизуют по сухому остатку и силе ингибирующего действия пантрипина. Проводят стерилизующую фильтрацию, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке.

Очистка индивидуальных ферментов продолжается несколько дней и состоит из ряда многократно повторяющихся операций.

Проводят 3-кратное высаливание ферментов аммония сульфатом до различной степени насыщения, изменяя значения рН. Каждый раз из фильтрата предварительно удаляют балластные вещества осаждением аммония сульфатом меньшей концентрации, чем применяемая при высаливании ферментов, затем осуществляют 5-кратную перекристаллизацию ферментов. Химотрипсиноген и трипсиноген активируют до образования химогрипсина и трипсина в соответствующих буферных растворах при пониженной температуре при добавлении кристаллика трипсина. Обессоливают ферменты диализом через целлофановую пленку. Сульфат-ионы осаждают бария хлоридом, а избыток иона бария удаляют на катионите КУ-2. В обессоленных растворах ферментов устанавливают необходимое значение рН, определяют концентрацию сухого вещества и разбавляют водой дистиллированной в соответствии с конечным содержанием сухого препарата во флаконах. Разбавленные растворы фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке.

Дезоксирибонуклеаза (Desoxyribonucle-asa) представляет собой лиофилизированный белый порошок, легко растворимый в воде; значение рН 0,1% водного раствора составляет 3,0-5,5. В водных растворах фермент нестоек (срок годности 12 ч), термолабилен, инактивируется при температуре 55 ^йС. Активность определяют по образованию кислоторас-творимых продуктов, освобождаемых препаратом из ДНК в определенных условиях, и выражают в единицах активности (ЕА). В ( мг препарата должно содержаться не менее 1700 ЕА. Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 5, 10, 25 и 50 мг.

Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 20°С. Применяется как средство, вызывающее деполимеризацию и разжижение гноя и задерживающее развитие вирусов, содержащих ДНК (герпеса, аденовирусов и др.). Назначают в виде аэрозолей для ингаляций.

Рибонуклеаза аморфная (Ribonucleasum amorphum) - лиофилизированный порошок белого цвета, растворимый в воде. Активность определяют биологическим методом по количеству кислоторас-творимых веществ, освобождаемых препаратом в результате гидролиза кислоты рибонуклеиновой в определенных условиях. 1 ЕА соответствует 1 мг препарата. Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 10, 25, 50 мг. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 15°С. Применяют местно в виде аэрозолей для ингаляций, внут-риплеврально, внутримышечно при заболеваниях, сопровождающихся гнойно-некротическими процессами.

Химотрипсин кристаллический (Chy-motrypsinum crystallisatum) представляет собой блестящие чешуйки или порошок белого цвета, легко растворимый в воде, значение рН 0,2% водного раствора составляет 4,5-6,5. Водные растворы быстро инак-тивируются. Выпускают в герметически укупоренных флаконах, содержащих по 5 и 10 мг кристаллического химотрипсина. Хранят в прохладном (не выше 10°С), защищенном от света месте. Применяют как рибо-нуклеазу.

Трипсин кристаллический (Tr^psinum crystallisatum) представляет собой пористую массу или порошок белого цвета, легко растворимый в воде, значение рН 0,2% водного раствора составляет 3,0- 3,5. В нейтральных и щелочных растворах препарат быстро разрушается. Выпускают в герметически укупоренных флаконах или в ампулах по 5 и 10 мг. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 10°С. Применяют как химотрипсин.

Пантрипин (Pantrypinum) - ингибитор про-теаз (трипсина, химотрипсина и др.), представляет собой лиофилизированный порошок желтоватого цвета, хорошо растворимый в воде. Стандартизуют биологическим путем по способности понижать активность трипсина. В 1 г препарата содержится не мепсе 650 ЕД. Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 6, 12, 15, 20 и 30 ЕД. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 20°С. Применяют при панкреатитах, вводят внутривенно.

Препараты ферментов из семенников.

Роиидаза (Ronidasum) - препарат, содержащий фермент гиалуронидазу, получают из семенников половозрелого крупного рогатого скота. Семенники обрабатывают 2% раствором фенола в течение 5-15 мин, тщательно промывают водой, снимают оболочку и измельчают на волчке. Измельченные семенники заливают физиологическим раствором, содержащим 0,25% хлороформа в соотношении 1,0:0,5, и экстрагируют ро-нидазу при перемешивании в течение 35-40 мин. Экстракт отделяют фильтрованием, осадок отжимают под гидравлическим прессом, отжатую жидкость присоединяют к экстракту, разливают по кассетам из нержавеющей стали, сушат методом сублимации. Высушенный препарат измельчают в шаровой мельнице, расфасовывают в стеклянные флаконы по 5 и 10 г, герметически укупоривают. Хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре. Применяют наружно при лечении рубцов (ожоговых, послеоперационных), контрактур суставов.

Лидаза (Lydasum) -препарат гиалуронидазо-вого действия. Для получения лидазы измельченные семенники крупного рогатого скота обрабатывают 0,1 н. раствором кислоты уксусной в отношении 1:2 при температуре 10°С и перемешивании в течение 4 ч. Надосадочиую жидкость отделяют if ацетоном осаждают фермент гиалуронидазу. Осадок растворяют в воде и процесс осаждения ацетоном повторяют три раза. Освобожденный от ацетона осадок очищенной гиалуронидазы растворяют в воде, фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и высушивают методом сублимации. Выпускают во флаконах, содержащих по 64 УЕ (условные единицы) стерильного сухого вещества. Хранят в сухом, темном месте, при температуре не выше 15°С. Основными показаниями к применению лидазы являются контрактуры суставов, рубцы после ожогов и операций, анкилозирующий слондилоартрит, гематомы и др. Раствор вводят под кожу.