Оптические свойства биополимеров

Что обуславливает поглощение света НК? ГЦ основания. Белок – а\к с ароматическими циклами.

Коэффициент экстинкции (ε) у НК примерно одинаковый.

У белков коээфициент экстинкции сильно различается.

От чего зависит ε БП?

• От состава

• От конформации

Г ипер- и гипохромный эффект. Особенно хорошо проявляется для НК. При переходе в ss состояние ε увеличивается. Потому что пропадает эффект экранированности ГЦ оснований. Соответственно, больше квантов поглощается, и больше коэффициент экстинкции.

Э

Спектры поглощения РНК при разных температурах:

гипер(гипо)хромный эффект

то эффект используется для поиска точных температур плавления дуплексов.

Есть спектрофотометры с термостатированными кюветами. Можем задавать температуру.

В присутствии глицерина понижается температура плавления гетеродуплексов

Детекция биоплимеров в чистом виде ограничена. Только в случае НК коэф. экстинкции имеет разумные величины, при этом нужно использовать УФ, что для некоторых экспериментов неразумно и невозможно. Например, нельзя померить в теле модельного животного, или в геле, если он толстый. => нужны красители.

Окрашивание биополимеров

Опосредованная, непрямая детекция.

По сути, детектируем не сам БП, а некий маркер. Проблема в том, как этот маркер к БП присоединить.

Краситель, как правило, связывается засчет нековалентных взаимодействий.

Искажаются химические свойства БП

Не можем влиять на коэффициент связывания.

Достоинства:

• простота (как правило) введения красителя

• возможность ввести краситель непосредственно перед детекцией

• обратимость (как правило L) введения красителя

Недостатки:

• неколичественный (как правило) подход

• невысокие (как правило) специфичность и воспроизводимость

Недостаток – обратимость, т.к. от эффективности связывания зависит ε. Но это же и плюс, мы можем отделить потом БП от красителя.

Если используем расители, ковалентно связывающиеся – можем связывать стехиометрически. Но зато не можем потом отделить метку от БП.

Требования к красителям:

1. некая часть, обеспечивающая поглощение света и ↑ε.

2. часть, отвечающая за связывание с БП

3. заместители, увеличивающие растворимость

Чем эффективней взаимодействие с БП, тем ниже специфичность красителя

Окрашивание белков

Кумасси. Бриллиантовый голубой.

Синюшные гели

Нековалентное связывание с белком

Ядро – плоское, гидрофобное.

Боковые кольца – для придания гидрофильности. Но для связывания с белком не нужны и только мешают (((

Система вода-метанол для растворения, просто в воде не растворяется, т.к. очень гидрофобное.

Взаимодействия с белками – гидрофобные.

Высокий ε обеспечивает сопряженное ядро. Имеется выраженный максимум поглощения (в небольшом ∆λ) при 250.

Чувствительность R-250 ~10 мкг , G-250 до 1 мкг

Красители НК

Имеют низкую специфичность

Для НК: красители подбираются эмпирически

Как правило, красители-интеркаляторы, которые встраиваются между стопками оснований. Краситель должен быть плоский и небольшой, чтобы встраиваться между основаниями. И лучше +-заряженный.

Хороший краситель не должен связываться с белками!

Пиронин - окраска в приятный розовый цвет.

Специфично к РНК

Цитология: метиловый зеленый с пиронином, дифференциальная окраска ядер и ядрашек. Ядрышки – высокая концентрация РНК

Толуидиновый синий

Специфично к РНК

ДНК: бромистый этидий

Система из сопряженных колец, но компактная. Эта даже очень, т.к. интеркалиует в dsДНК

Макс. поглощения: 300, 336, 360, 445 нм Может использоваться в режиме поглощения, но эффективность очень низкая. Если взять много ДНК и красителя, то в геле при ярком освещении будет видна невооруженным глазом кирпично-красная полоска Макс. испускания (флуоресценции): 590 нм (красноволновая область) Флуоресценция усиливается при интеркаляции в dsДНК. При облучении УФ возбуждается не только ГЦ ядро красителя, но и оснований. Энергия передается с соседних возбужденных оснований на краситель. Режим не поглощения, а флюоресценции.

Чувствительность ~1-10ng (~10-9 g). Реально - 20 нг, 10 нг уже трудно различить

Акридиновый оранжевый:

Н иже чувствительность, менее эффективно собирает энергию соседних возбужденных ядер.

В процессе интеркаляции его собственная конформация изменяется таким образом, что изменяется макс спектроиспускания, т.е его цвет.

Очень полезно, для детекции продуктов real-time. Позволяет отделить фон от измеряемойвеличины.

λ max свободного 640 нм (красный) λ max интеркалированного 530 нм (зеленый) Чувствительность до 100ng (~10-7 g)

Со специфичностью беда. Очень часто красители НК взаимодействуют с белками.

S tainsAll –

универсальный краситель для биополимеров

Розовый

Эффективность невысокая.

Фрагменты молекулы более и менее специфично связывающиеся с разными классами БП

SYBR – семейство красителей, специфично окрашивающих НК. Используются для детекции продуктов ПЦР real-time.

Нековалентно связывают

Розовый краситель

Высокий коэффициент разгорания – 100 – 1000.

Будучи интеркалированным светится на 3-4 порядка интенсивнее, чем в растворе. Для продуктов ПЦР real-time это принципиально важно, т.к. надо суметь зарегистрировать очень малые концентрации продуктов в присутствии фонового красителя

Некоторые используются вместо бромистого этидия, т.к. чувствительность выше.

Дорого

Окрашивание после процесса. Коэффициент интеркаляции зависит от концентрации. Если окрашивать до, э\ф пострадает, т.к. подвижность флуктуирует.