Красители, присоединяющиеся ковалентно

Меченые флуорозромами ddNTP для 4-х канальной детекции продуктов терминации по Сэнгеру

Метки отличаются по спектру. Хотя в приборах для возбуждения используется одна и та же длина волны.

Проблема: с одной стороны, как можно сильнее метки должны отличаться по спектру испускания; с другой стороны, спектр испускания повторяет спектр поглощения, только в более коротковолновой области, и в результате не все метки эффективно возбуждабтся одной длиной волны.

Метка сильно искажает свойства молекулы. Так что не понятно, кто субстрат.

«Родаминовое чудовище»

Чтобы облегчить жизнь ферменту, используется ацетиленовая вставка, дабы отодвинуть метку от ddNTP. Но все равно используются генно-модифицированные ферменты, т.к. природные отказываются распознавать.

Есть прогресс или нет его? Эволюция этих красителей парадоксальна. Попытки раздвинуть пики испускания не особо удачны. Да еще и перестали эффективно возбудаться одним лазером. 2-лучевые лазеры – дорого, и плохо.

Тогда придумали систему с внутримолекулярым переносом энергии. Концепция «большого красителя» Помимо группы, которая обеспечивает спектроиспускание, вводится еще одна группа, общая для всех типов которая обуславливает спектропоглощение. Она поглощает в более коротковолновой области, чем все испускающие групп. Почему? Потому что ее энергия возбуждения должна быть выше, чем энергия возбуждения других групп. И эта энергия передается внутримолекулярно.

Но тогда масса самого ddNTP бывает меньше 10%.

Использование меток физической природы

Квантовый ДОК?

Флоресцентные нанокристаллы.

Полупрофодниковые резонаторы, квантовые, очень близки к идеальным меткам.

Очень узкий спектр, очень высокий квановый выход.

Идеальный спектр – очень узкий прямоугольк, а не помятая гауссиана.

Из молекул такое сделать нельзя. Остается физическими методами сделаь идеальный резонатор.

Селенид Кадмия, в идеале сферический. Покрыт полупрозрачным зеркалом, в идеале совсем зеркалом. Образуется резонансная система, настроенная строго на определенную длину волны, которая обуславливается диаметром сферической частицы.

Итого надо добиться создания частицы с заданным диаметром идеальной сферической формы. И соответственно, получим идеальную спктральную характристику.

Одна проблема. Присоединить такую частицу к БП сложнее, чем метку или краситель.

Надмолекулярный, нанообъект.

Если в качестве зеркала использовать ZnS, то с помощью S-S-мостков можно присоединить нечто, что уже присоединится к БП. Например, альдегид для присоединения к белкам. Можем даже антитело присоединить.

Естественно, получить идеальную сферическую частицу не просто, и сразу не получилось.