Ионообменная хроматография

Электростатическое взаимодействие вещества и сорбента.

Должны быть ионогенные группы.

Несколько особняком стоят хелатные сорбенты, которые образуют комплексы. Есть сорбенты, которые имеют хелатные свойства, и одновременно являются катионообменниками.

Собираются сорбенты просто.

Матрикс, котры служит для размещения ионных групп

Полистирол, сефадекс. Вообще сорбенты для гель-фильтрации годятся.

В фильтрах воды – тоже полистиролсодержащие ионообменные. Удаляют 2-х и трехвалентные катионы. Но сам полистирол вещество нестабильное, деполимеризуется, распадается с образованием стирола (винилбензол), вещество еще менее полезное, чем Ca и Fe. В дорогих системах очистки ионообменная – только первая ступень, потом еще вторая, сорбционная, активированным углем, удаление продуктов деструкции полистирола.

Полистирол вообще плохаяпластмасса, она даже пахнет плохо.

Группы могут быть сильно ионогенными, в широком диапазоне рН будут иметь фиксированный заряд. Например, четвертичные амины. Или сульфогруппа. А вот карбоксигруппу можно протонировать, и при низких рН можно управлять плотностью заряда, и, соответственно силой связывания. Есть даже ионообменники с изоэлектрической точкой, где можно менять знак заряда.

Изменяя рН, можем управлять зарядом как разделяемых частиц, так и ионообменника.

Стационарная фаза для ионообменной хроматографии:

	Dow Chemical	Rohm & Haas	Bio-Rad	Pharmacia
Полистирол Ph -CH2SO3-	Dowex 50-Xn	Amberlite IR-112,120, 122,124	AG-50W-Xn
Полистирол Ph -PO3-			Bio Rex 63
Полистирол Ph -COO-		Amberlite IRС-50,84
Полистирол Ph -CH2N(CH2COO-)2 (хелат)			Bio Rex 70
Полистирол Ph -CH2N+(CH3)3(C2H4OH)	Dowex 21K, 2-4, 2-X8	Amberlite IRA-410	AG-2-Xn
Полистирол Ph-H2N+(CH3)3	Dowex 1-Xn	Amberlite IRA-400,401	AG-1-Xn
Sefadex –C2H4N+ (C2H5)2H				DEAE A-25, A50
Sefadex –C2H4N+ (C2H5)2CH2CH(OH)CH3				QAE A-25, A-50
Sefadex -CO2-				CM C-25, C-50
Sefadex –C3H6SO3-				SP C-25, C-50
Bio-Gel -CO2-				CM-2, Carboxy P-2

2 пути увеличения степни разделения:

1. улучшение хроматографической системы – увеличение числа ТТ: колонка высокая и тонкая, сорбент лучше монолитный. Если КР близки, не поможет

2. Раздвинуть КР, например, изменяя рН.

Аффинная хроматография

ОЧЕНЬ много вариантов. Фактически, конструируем сорбент. Дают заготовку, полистирол, активированный, на нем какой-нибудь синтол (например, бромциан-сахароза). Дальше пробирочке смшал, и оно пришилось. Например, присоединить белки, например антитела.Или система стрептовидин-биотин.

Например, получаем моноклональные АТ и с их помощью извлеваем гаптен из смеси. Даже ртуть можно использовать.

Хроматография – самый старый из рассмотренных нами канонических методов.

Она даже мало изменилась. И даже оборудование, только дизайн улучшился.

Единственный серьезный шаг – монолитные сорбенты

Типичный прибор

Колонка, система подачи

Обычно используется проявительный способ

Либо элюент одного состава, либо градиент.

Должна быть возможность в автоматическом режиме вносить пробы – система клапанов.

Насос, который контролирует очень точный объем подаваемого элюента либо вносимых проб

Детектор (в простейшем случае спектрофотометр)

Цена определяется качеством детекторов, насосов, а не собственно колонкой.

Использование ПЦР для точного определении концентрации НК

Придумали в 70-х годах

Это же кайф – исследование экспрессии генов, которые выражаются в 3-100 РНК на клетку.

Полуколичественный ПЦР

Точность крайне невысока. Причем настолько невысока, что невозможно даже примерно оценить, не то что точно.

Множество дискуссий, переходящих к рукоприкладству.

И пришли к выводу, что полуколичественный ПЦР вообще не может вступать в качестве количественной оценки концентрации. Можно рассматривать как констатацию факта, что НК там есть.

Проблема в том, что мы оцениваем не в процессе, а после какого-то цикла, после прекращения реакции.

П ЦР описывается сначала фазой экспоненциального роста, концентрация в которой описывается формулой коэффициент амплификации в степени число циклов. В идеале к=2, но в реале несколько меньше.

Потом плато, через точку перегиба, от количества циклов уже концентрация не зависит.

Почему?

1. Чем вызвана максимальная концентрация, которой может достичь продукт, независимо от того, сколько его было вначале? (дальше будут нарабатываться только побочные продукты)

При этом предположим, что в системе всего достаточно. И праймера, и трифосфата, и фермента.

Критическая концентрация – 0.1-0.5 мкм дцДНК в зависимости от длины и состава матрицы.

Реакция будет конкурировать с прймером за образование дуплекса.

У праймера очень хорошая кинетика, быстро связывается, но плохая термодинамика – быстро вылетает, и образуются дуплексы. По мере роста концентрации 2-й цепи в смеси вероятность вытеснить праймер увеличивается. И наконец она становится такой низкой, что фермент не успевает даже узнать затравочный комплекс.

2. Почему не достигается даже это концентрация?

В случаях, когда было мало исходной ДНК?

Циклов было много, и фермент инактивировался

Случай конкуренции за фермент

Взяли лаборанта, в 96-луночный планшет заставили раскапать одинаковую смесь, поставили на одинаковый амплификатор. Результат потрясал. Отличия в 7 раз! А физиологи говорят, что различия в 20% уже значимые.

Предположим, добавим 2 ДНК, в разных концентрациях. Если мы доведем дело до истинного плато, когда концентрация обусловлена длиной и составом ампликона, сохранится ли в этой точке хоть какая-то концентрация о начальных концентрациях?

Нет.

Если первой было больше в 8 раз, то подъемы будут параллельны, но первый начнется раньше на 2 цикла. А когда достигнут плато, будут одинаковыми.

Если нам повезло, и мы не успели, и нанесли на ГЭФ точку с плато, тот ничего не поймем. И никаких нормальных математических методов, на которые так надеялись физтологи, не приложишь.

А если мы сами устроим конкуренцию за фермент. Можно сделать вывод о начальных концентрациях. Вопрос – насколько. Можно задуматься над методами. Хотя бы оценить, насколько. Хотя тоже легко подвергается критике.

Как все-таки предполагали оценивать и проводить эксперименты по полуколичественной ПЦР?

Всегда предполагалось наличие стандарта, матрицы с известной концентрацией.

Метод основан на измерении флюоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта ПЦР.

2 варианта постановки эксперимент:

1. конкурентный ПЦР, где ресурсов мало, и абсолютная концентраия в принципе не достигается

добавлям разные кол-ва стандарта, откладываем по о lg количества стандарта, и На втором графике откладываем измеряемые нами соотношения стандарта и образца, тоже lg. Стандарт обычно отличается по размеру, немоного, недостаточно, чтобы его отдельно детектировать.

Рассуждения простые. Там, где отношение 1 а lg=0, видимо, одинаковые концентрации. Проецирум на ось, определяем количество неизвестной матрицы.

То, что точки ложатся на наклонную линию, характеризует факт наличия конкуренции.

Если не будет конкуренции? Будет прямая линия, параллельная оси

Отношение меняться не будет, пока идет фаза подъема. Отношении возникает из-за того, что происходит перераспределение ресурсов между матрицами. На платно соотношение будет 1.