Пцр неконкурентный
Единственный шанс – работать в зоне, когда плато еще нет. Ограничение, не можем работать в зоне экспоненциального роста, т.к. продукта еще мало. А на этом этапе (в этот период?) методы детекции еще несовершенны.
В логарифмических координатах можем работать только на очень узком участке кривой.
Можем нанести на агарозный гель 0.5 мкг, без особого искажения результатов. Детектировать можем не менее 5-10 нг. Если у нас, скажем 50 нг, то у нас динамический диапазон – 10 раз. А это т динамический диапазон перекрывается всего 3-4 цифрами ПЦР.
Значит нашим методом детекции мы можем перекрыть всего 3-4 точки, которые еще не достигли плато. В этом трудность.
Что предлагают? Мерить количество стандарта, менять его, шкала не логарифмическая!
Ставим абсолютное количество ампликонов, они теперь независимы. Детектируем оба бенда на форезе, и отдельно их измеряем и откладываем.
Что мы должны увидеть? – количество матриц не меняется: мы изначально добавили ее в одинаковом количестве во все пробирки, а количество стандартов было разное.
Если мы попадем на плато, увидим 2 прямые, причем горизонтальная линия стандарта.
Линия стандарта – прямая, 45º
Там, где линии пересеклись, концентрация матрицы соответствует концентрации стандарта.
Почему все не хорошо в реале? Все не так.
Возникает вопрос, какие бывают стандарты. Откуда мы знаем, что к амплификации стандарта в точности равен к амлификации матрицы?
Иначе все предыдущие методы анализа превращаются в пустую говорильню – точки эквивалентности на графике не соответствуют точкам эквивалентным количествам, если к амлификации разный..
Если к амлификации отличается на 5%, а циклов будет небольшое количество, например, 25 – то эквивалентные количества разойдутся в 3.6 раз. А при несовпадении к амлификации в 15% - 58 раз. Т.е, ни о каких количественных оценках речи уже не идет.
Что нам нужно, чтобы предположить, что к амлификации одинаковый? Нам нужен гомологичный стандарт
Стандарты: гомо- и гетерологичные, эндо- и экзогенные.
Эндогенные стандарты: используем то, что у нас уже есть
Экзогенные – вынуждены добавлять извне.
Гомологичный стандарт образуется с использованием тех же праймеров, и желательно состав тот же самый.
Обычно как делают почти гомологичный стандарт: берут вашу матрицу, клонируют ее, и вставляют в средину маленький кусочек, чтобы она по длине отличалась, чтобы мы могли ее детектировать, состав нуклеотидный почти такой же.
В реальной жизни трудно использовать такие стандарты. При работе с клетками и тканями вынуждены добавлять извне, и как правило все гомологичные стандарты - экзогенные.
В качестве эндогенных стандартов берут гены белков домашнего хозяйства – β-актины, например, которые в клетке экспрессируются с известным уровнем. И тогда на них нормируют те мРНК, экспрессию которых хочется определить. Но тогда этот стандарт автоматически гетерологичный, и надо убедиться, что к амлификации тот же.
Real-time ПЦР
Чем хорош?
Если мы сможем измерить 3-4 точки на экспоненциальной фазе – сможем довольно таки точно определить начальные концентрации и коэффициент амплификации, при условии, что он не меняется.
Причем если 4 – можем даже определить ошибку.
Одна проблема, концентрации очень маленькие.
Направления развития методы:
Неинвазивные методы детекции – чтобы ферменту немешать
Чувствительность
EtBr не подойдет – во первых, ферменту мешает, во-вторых, чувствительность низкая.
Вводится понятие уровень отсечки – концентрация, которую можно достоверно детектировать, ошибкой можно пренебречь, но все еще находится в зоне экспоненциального роста.
Для нормализации можно использовать стандарты,
Товарищу, который сумеет подобрать математическую модель, описывающий поведение ПЦР после точки перегиба, после окончания экспоненциальной фазы, наверное Нобелевк дадут.