Какие проблемы мы можем решать?
Есть пептид в смеси, хочу посмотреть, из каких фрагментов состоит, чтобы реконструировать его состав.
Аналог – при исследовании белка его сначала делят на блоки – проводят трипсинолиз. А потом методом Эдмана
Мы проводим что-то аналогичное. Квадруполь настраиваем так, что на выход попадает только нужный нам определенный петид, ионы разделяют его на фрагменты. Квадруполь на выходе перестраиваем так, что фрагменты выходили по очереди – проходимся по всем диапазонам масс. Регистрируем.
Допустим, есть класс веществ, который содержит один и тот же фрагмент. Например, продукты модификации одного и того ж полипептида. Хочется собрать сведения о всех фрагментах.
Надо создать условия.
Например, все эти полипептиды содержат один и тот же фосфорилированный фрагмент.
Настриваем квадруполь 3, на выходе, на фосфорилированный фрагмент. Квадруполь на входе перестраиваем и смотрим, белки с какими молекулярными массами дают нам сигнал о фосфорилировании.
Можем синхронно перестраивать входной и выходной квадруполи. Можем найти, какие БП в ионной камере теряют один и тот же фрагмент.
Регистрации продуктов по времени, без накопления, более точна. Но с накоплением, с использованием ионной ловушки – больше чувствительность.
Тройной квадруполь:
Преимущества
МС/МС в пространстве
Возможность отделения ионов вещества от фона
Режимы «выброс нейтрального фрагмента», «сканирование прекурсора»
Отсутствие пространственного заряда (space charge)
Большой динамический диапазон
Недостатки
Относително низкий коэфф. использования ионов
Низкая чувствительность в режиме сканирования
Нет возможности повысить разрешение
Только МС/МС – иногда недостаточно для установления структуры
Ионная ловушка
Преимущества
Высокая производительность в режиме сканирования
Высокая чувствительность в режиме сканирования
Небольшой размер
Недостатки
Небольшой динамический диапазон
Отсутствие режимов «выброс нейтрального фрагмента», «сканирование иона-предшественника»
Возможность появления пространственного заряда при перегрузке ловушки (space charge)
Лимитированная энергия столкновения
Правило 70:30
Нет предварительного отсева ионов фона
Еще одна возможность МС – если фрагментируем белок до а/к, можно определить состав – хорошая альтернатива методу эдмана.
Ни один простой Малди так не может.
Можем даже анализ разнести во времени.
На приборе можно исслед смеси – такой крутой прибор.
Соревнование – выделить и идентифицировать как можно больше протеинов из 10 000 клеток
Однако, более 20 тысяч.
Малди на матрице генерирует много положительных сигналов, которые потом не подтверждаются.
Метод имеет огромный динамический диапазон: от 1 молекулы до 1 млн.