91.Афинная хроматография

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации.

ТИПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В АХ

Фермент <=> Субстрат; Антитело <=> Антиген, вирус, клетка ; Агглютинин (лектин) <=> Агглютиноген (полисахарид, гликопротеин, рецептор клетки); Нуклеиновая кислота <=> Последовательность комплементарных оснований, гистоны, НК-полимеразы, НК-связывающие белки ; Гормон, витамин <=> Рецептор, белок-носитель ; Глутатион <=> Глутатион-S-трансфераза, гибридный белок ; Ион металла <=> Полигистидиновый таг гибридного белка (металл-хелатная ах

Применение АХ

1. Выделение рекомбинантного продукта непосредственно из культуральной жидкости.

Культуральная жидкость наносится на колонку, упакованную афинным к целевому белку сорбентом. Только целевой белок сорбируется, а примесные (баластные) белки элюируются без сорбции.

2. Высокопроизводительная очистка ферментов.

АХ не приводит к денатрации ферментов или потери активности, поэтому представляет собой замечательный метод для специфической очистки. Сродство сорбента к ферменту основано, как правило, на специфическом связывании активного центра.

3. Очистка гибридных белков.

Гибридный белок - это рекомбинантный предшественник целевого белка, имеющий в составе особую ДНК-кодируемую последовательность аминокислот (называемую лидерным фрагментом), выполняющую роль маркера экспрессии. Т.е. ГБ=целевой белок+лидерный фрагмент. Последовательность ГБ, биосинтезируемая штаммом-продуцентом, определяется на генетическом уровне (великими дяденьками - генными инженерами). Генные инженеры могут конструировать такой лидерный фрагмент, который может облегчить афинную очистку. Такой лидерный фрагмент называется ТАГ.

Основные ТАГи:

- глутатион-S-трансферазный (GST-ГБ). Афинен к сорбенту за счет глутатионного остатка, который вступает с таким же остатком сорбента во взаимодействие, образуя дисульфидное производное.

- полигистидиновый (ПолиГис-ГБ). Способен к координации вокруг никеля (2+), которым иммобилизован сорбент. Образуемый металл-хелатный комплекс дает другое название такому методу АХ - металл-хелатная хроматография.

4. Удаление из гидролизата ферментов класса сериновых протеаз (тромбин, трипсин, зимоген).

Выделение ГБ сопровождается высвобождением протеолитических ферментов продуцента, которые могут гидролизовать ГБ. Сериновые протеазы, имеющие специфичность к оснОвным аминокислотам (аргинину и лизину), вынуждают исследователей применять ингибиторы протеаз, что зачастую неудобно. Альтернатива: использовать АХ. Достоинства АХ: защита ГБ от протеолиза; очистка протеаз.

Основные лиганды АХ, которые используются для этих целей:

- синтетический ингибитор парааминобензамидин;

- аргининовый остаток.

5. Выделение ДНК-связывающих белков.

ДНК-связывающие белки - класс белков, которые благодаря сродству к НК способны:

- к репликации и ориентации молекул ДНК (гистоны, нуклеосомы, репликазы)

- к участию в транскрипции (ДНК-полимеразы, активаторы транскрипции, репрессоры, рестриктазы).

Лиганд сорбентов:

- гепарин (гексуроновая кислота+D-глюкозамин)

6. Очистка гликопротеинов, гликолипидов, полисахаридов.

Гликолипиды, гликопротеины и полисахариды способны обратимо связываться с лектинами. Т.е. лектины можно использовать как лиганды для иммобилизации сорбентов.