5. Хроматографія

Хроматографія – метод розділення газів, парів, рідин і розчинних речовин на межі двох фаз – рухомої і нерухомої.

За механізмами розділення хроматографію поділяють на адсорбційну (газову або рідинну),осадову, іонообмінну, розподільчу, гель-фільтраційну (гель-хроматографію) і біоспецифічну (афінну) ; по формі проведення – на колонкову, хроматографію на папері і тонкошарову. Для фракціонування білків застосовується головним чином хроматографія на колонках.

Хроматографія на папері – один із видів розподільної хроматографії.

Метод базується на різниці коефіцієнтів рухливості роздільних речовин між

двома погано змішуваними розчинниками. В якості носія нерухомої фази використовують спеціальний хроматографічний папір. Він повинен бути хімічно чистим, однорідним по густині і забезпечувати визначену швидкість

руху розчинника. Досліджувану речовину, що знаходиться в розчині, наносять у вигляді крапель на деякій відстані від краю на листок хроматографічного паперу. Папір розміщують в герметично закриту камеру і занурюють край листка, де був нанесений досліджуваний розчин, в кювету, що містить органічний розчинник. Лінія старту з нанесеними на неї пробами не повинна занурюватись в розчинник. За силами капілярності органічний розчинник буде рухатись вздовж листка хроматографічного паперу. Нанесена на папір речовина рухається за розчинником. Ступінь сорбції досліджуваної речовини на гідратованих волокнах паперу (повітряно-сухі листки фільтрувального паперу в камері, насиченої парами 10ад осадову10тов органічного розчинника, містить до 20% води) визначає швидкість його руху. Речовини, що гірше сорбуються на гідратованих волокнах паперу, будуть рухатися швидше. Після проходження фронтом розчинника певної відстані папір висушують і обробляють тою чи іншою проявляючою речовиною. Паралельно з дослідним розчином на цей листок паперу наносять стандартний розчин досліджуваної речовини (свідок), який буде вказувати місце знаходження речовини, що визначається. Для ідентифікації речовини можна також користуватися величиною Rf, яка являється відношенням відстані, яку дана речовина пройшла, до відстані, яку пройшов фронт розчинника. Велична Rf залежить від розчинника. Розрізняють висхідну (розчинник піднімається по паперу вверх) і низхідну (розчинник рухається вниз) хроматографію.

Загальні прийоми хроматографічного розділення на колонках

Найпростіший пристрій для хроматографічного розділення має наступну будову: колонки – порожні скляні трубки, розмір яких залежить від мети роботи і способу розділення . В основі колонки вмонтовано пористу скляну пластинку або перфорований диск. Необхідно слідкувати за тим, щоб

«мертвий» простір під диском, між ним і основою колонки, а також внутрішній діаметр шлангів, по яких елюат, що виходить із колонки, потрапляє в колектор фракцій, був мінімальним. В зворотному випадку відбувається змішування вже розділених речовин. Комерційні колонки оснащені спеціальними пристосуваннями – кінцевими адаптерами перемінної довжини, які дозволяють регулювати довжину колонки і зводять до мінімуму перемішування фракцій, що підлягають елююванню.