- •§ 1. Природные носители
- •§ 2. Синтетические полимерные носители
- •§ 5. Природные носители (липиды)
- •§ 7. Макропористые кремнеземы
- •§ 8. Другие неорганические носители
- •§ 1. Носители для адсорбционной иммобилизации
- •2. Методика адсорбционной |м мобилизации
- •§ 3. Природа адсорбционных взаимодействий фермента с носителем
- •§ 5. Способы увеличения эффективности связывания фермента с носителем
- •§ 6. Преимущества и недостатки адсорбционной иммобилизации
- •§ 7. Иммобилизация ферментов в гелях, полученных полимеризацией мономеров
- •§ 8. Иммобилизация ферментов в гелях, полученных из готовых полимеров
- •§ 9. Влияние различных факторов
- •§10. Преимущества и недостатки иммобилизации ферментов путем включения в гель
- •§ 11. Микрокапсулирование
- •§ 12. Двойное эмульгирование
- •§ 13. Включение в волокна
- •§ 14. Включение в лилосомы
- •§ 15. Преимущества и недостатки иммобилизации с использованием полупроницаемых оболочек
- •§ 16. Двухфазные системы типа
- •§ 17. Микромульемм
- •§ 1. Основные принципы конструирования препаратов ковалентно иммобилизованных ферментов
- •§ 2. Химическая структура ферментов и их функциональные группы
- •§ 3. Приемы химической (ковалентнон) им мобилизации белков
- •§ 4. Недостатки и преимущества получения
- •§ 1. Кинетические параметры ферментативных реакций
- •§ 2. Влияние иммобилизации на состояние фермента
- •§ 3. Эффекты распредепения реагентов в катализе иммобилизованными ферментами
- •2 Cosh of -- I
- •1. Распределение протонов- в качестве примера рассмотрим
- •§ 1. Воздействия и вещества, вызывающие инактивацию ферментов
- •§ 2. Молекулярные механизмы инактивации ферментов
- •Лиэинояланин
- •Op нйтиноаланн н
- •§ 3. Влияние иммобилизации на инактивацию ферментов
- •§ 4. Подавление с помощью иммобилизации первичных обратимых стадий денатурации и диссоциации матнвных белков
- •§ 5. Пучи стабилизации ферментов,
- •§ 1. Реактивация инактивированных ферментов
- •§ 2. Регенерация кофакторов (коферментов}
- •V фермент б /
- •37, 41. 42, 44, 47, 79, 80 Фосфорилирование 124, 127
§ 12. Двойное эмульгирование
При иммобилизации методом двойного эмульгирования (Т. Чаш, 1965) сначала готовят эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе полимера, точно так же, как было описано для случая получения микрокапсул первым способом. Готовую эмульсию вновь диспергируют, на этот раз в воде. В результате получается водная эмульсиая из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие включенные капли водного раствора фермента (рис. 9,6). Через некоторое время органический раствор затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с иммобилизованным в них ферментом.
С. Мэй и Н. Ли (1972) предложили модификацию этого способа иммобилизации, в котором в качестве материала для образования мембраны вместо водонерастворимого отверждаю-щегосн полимера используются жидкие углеводороды с большой молекул ирной массой. Этот метод получил название иммобилизации путем включения в жидкие мембраны,
§ 13. Включение в волокна
От микрокапсул и рованн я этот способ иммобилизации» предложенный Д. Динелли (1972), отличается главным образом формой получаемых препаратов: в первом случае образуются сферические микрокапсулы» а во втором — нити. Суть состоит в томт что Змульсию водного раствора фермента в органическом растворе волокнообразуюшего полимера (производные целлюлозы, полнейнилхлорид, пол и-Л-метил глута мат) продавливают через фильеры в жидкость {например, толуол), вызывающую коагуляцию полимера. Полученные волокна представляют собой пористые полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента размером около I мкм (рис. 9,е). Ферментсодержащне волокна обладают высокой механической прочностью; например, из них можно изготовить ткань, которая будет обладать ферментативной активностью. Для дополнительного повышения механической прочности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную оболочку.
Для иммобилизации ферментов можно использовать также производимые промышленностью готовые полимерные полые волокна, которые применяют для очистки белков методом диализа (рис. 9, г). Полые волокна изготавливают из природных или синтетических полимеров (целлюлоза, поли вин ил хлорид, полисульфон, полиакрил а мид); они имеют внешний и внутрен-
70
ний диаметр порядка нескольких сотен микрометров при толщине мембраны в несколько десятых микрометра. Для проведения ферментативной реакции волокна, по которым циркулирует раствор фермента, погружают в сосуд с раствором субстрата,
диффундирующим через мембрану внутрь волокон.
§ 14. Включение в лилосомы
Впервые липосомы были использованы для включения ферментов Дж. Сесса и Дж. Вайсманом (1970). Значительный вклад в развитие этого направления принадлежит также Г. Гре-гориадису. Существует несколько способов получения липосом, содержащих включенный фермент (рис. 9, д). В одном из инх раствор липида (обычно лецитина) в органическом растворителе (например, в хлороформе) упаривается в вакууме» и липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят водный раствор фермента, встряхивают до полного удаления пленки липида со стенок колбы и оставляют на некоторое время. В полученной таким образом дисперсии липида происходит самопроизвольное образование (самосборка) мультила-меллярных липосом, содержащих включенный фермент. Во избежание окисления липида все операции необходимо проводить в атмосфере инертного газа.
В другом варианте метола раствор липида в органическом растворителе наслаивают на поверхность водного раствора фермента, после чего органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся ли пи дну ю пленку диспергируют в водном растворе. Недостаток этого способа состоит в том, что контакт с органическим растворителем может вызвать инактивацию фермента.
Для удаления невключившегося фермента липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. В случае моноламеллярньн липосом, получаемых путем ультразвуковой обработки, разделение проводят методом гель-фильтрации на колонке.
Ферменты, иммобилизованные путем включения в липосомы, применяются главным образом в медицинских целях, а также при проведении фундаментальных исследований, поскольку такие системы близки к природным мембранам и их изучение может дать полезную информацию о ферментативных процессах в клетках.
Недавно был предложен новый способ иммобилизации фер ментов путем включения их в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи (см. гл. 1), После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированного липида обычным способом, их подвергают облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора. При этом происходит полимеризация мономерных молекул липи-
71
да с образованием ковалентно сшитой замкнутой лилидной бмслойной мембраны. Полимерные липосомы обладают гораздо более высокой стабильностью по сравнению с обычными.