- •§ 1. Природные носители
- •§ 2. Синтетические полимерные носители
- •§ 5. Природные носители (липиды)
- •§ 7. Макропористые кремнеземы
- •§ 8. Другие неорганические носители
- •§ 1. Носители для адсорбционной иммобилизации
- •2. Методика адсорбционной |м мобилизации
- •§ 3. Природа адсорбционных взаимодействий фермента с носителем
- •§ 5. Способы увеличения эффективности связывания фермента с носителем
- •§ 6. Преимущества и недостатки адсорбционной иммобилизации
- •§ 7. Иммобилизация ферментов в гелях, полученных полимеризацией мономеров
- •§ 8. Иммобилизация ферментов в гелях, полученных из готовых полимеров
- •§ 9. Влияние различных факторов
- •§10. Преимущества и недостатки иммобилизации ферментов путем включения в гель
- •§ 11. Микрокапсулирование
- •§ 12. Двойное эмульгирование
- •§ 13. Включение в волокна
- •§ 14. Включение в лилосомы
- •§ 15. Преимущества и недостатки иммобилизации с использованием полупроницаемых оболочек
- •§ 16. Двухфазные системы типа
- •§ 17. Микромульемм
- •§ 1. Основные принципы конструирования препаратов ковалентно иммобилизованных ферментов
- •§ 2. Химическая структура ферментов и их функциональные группы
- •§ 3. Приемы химической (ковалентнон) им мобилизации белков
- •§ 4. Недостатки и преимущества получения
- •§ 1. Кинетические параметры ферментативных реакций
- •§ 2. Влияние иммобилизации на состояние фермента
- •§ 3. Эффекты распредепения реагентов в катализе иммобилизованными ферментами
- •2 Cosh of -- I
- •1. Распределение протонов- в качестве примера рассмотрим
- •§ 1. Воздействия и вещества, вызывающие инактивацию ферментов
- •§ 2. Молекулярные механизмы инактивации ферментов
- •Лиэинояланин
- •Op нйтиноаланн н
- •§ 3. Влияние иммобилизации на инактивацию ферментов
- •§ 4. Подавление с помощью иммобилизации первичных обратимых стадий денатурации и диссоциации матнвных белков
- •§ 5. Пучи стабилизации ферментов,
- •§ 1. Реактивация инактивированных ферментов
- •§ 2. Регенерация кофакторов (коферментов}
- •V фермент б /
- •37, 41. 42, 44, 47, 79, 80 Фосфорилирование 124, 127
§ 1. Кинетические параметры ферментативных реакций
В простейшем случае скорость (v) катализируемой ферментом реакцни анализируется в рамках уравнения Михаэлиса— Ментен;
97
где [£]о и [S]o — концентрация фермента и субстрата в системе соответственно; к^т — каталитическая конгтантз ферментативной реакции; /СМлаж — определяемое эффективное (кажущееся) значение константы Михаэлиса.
Параметр Лм_язж служит характеристикой сродства фермента к субстрату нт следовательно, является мерой той концентрации субстрата, которая необходима для насыщения фермента. При катализе иммобилизованными ферментами концентрация субстрата вблизи фермента (локальная) может отличаться от концентрации субстрата во всем объеме системы. В этом случае наблюдаемая на опыте Кп.каж должна зависеть от распределения субстрата-между свободным раствором и носителем, где сосредоточен фермент. Что касается параметра ^„ат1 то он характеризует реакционную способность уже образовавшегося фермент—субстратного комплекса, поэтому не зависит от распределения субстрата в системе, а определяется состоянием, в первую очередь, конформици^й самого фермента.
Каталитические параметры ферментативной реакции (ftraT и Км.каж) могут зависеть от наличия в реакционной системе раз* личных эффекторов, таких, как ингибиторы и активаторы, ионы водорода и т. п. В таких случаях необходимо учитывать распределение также этих эффекторов между раствором и фермент-содержащей матрицей.
Таким образом, все кинетические эффекты, наблюдаемые при катализе иммобилизованными ферментами, можно разделить на две группы. К первой из них относятся эффекты, связанные с влиянием иммобилизации на состояние (конформацию) фермента, а ко второй — эффекты, обусловленные распределением реагентов в системе.
§ 2. Влияние иммобилизации на состояние фермента
Информационные свойства иммобилизованных ферментов. При иммобилизации существует опасность, что белок присоединится к носителю в конформацни, отличной от нативной. В этом случае каталитическая активность фермента может существенно измениться или вообще исчезнуть.
Вопрос о том, произошли ли в белке конформационные изменения при иммобилизации, решается исследованием структург>1 иммобилизован мы к ферментов физическими методами. Для этой цели с успехом использовали оптические методы (спектрофото-метрическии, флуоресцентный), метол спиновых меток и др. Анализируя данные этих исследований, можно сделать следующие выводы.
1. В результате иммобилизации пространственная структура фермента может либо существенно измениться, либо измениться незначительно, либо остаться неизменной (что наблюдается чаще всего).
2. В тех случаях, когда конформация нативного и иммобилизо-
98
ванного ферментов различается, это обусловлено одной из трех причин. Во-перных, конформационпые различия могут быть обусловлены химической модификацией каких-либо важных д^я структуры функциональных групп белка и не связаны с самим процессом иммобилизации фермента (т. е. его присоединением к носителю). Чтобы устранить действие этого фактора, необходимо выбрать соответствующий метод иммобилизации не затрагивающий этих функциональных групп в белке. Кроме того» часто фермент удается защитить от инактивации на стадии иммобилизации простым добавлением субстрата или другого специфического л и ганда в насыщающей концентрации, что позволяет получать препараты с более высокой удельной каталитической активностью (т, е. активностью» отнесенной к I r носи-теля}-
Во-вторых, причиной искажения структуры фермента могут быть неспецифические взаимодействия (электростатические, гидрофобные, водородные связи) между ферментом и носителем, приводящие к денатурации. Чтобы избежать этих взаимодействий, иногда достаточно заменить носитель на инертный по отношению к белку. Такой инертностью обычно обладают поли-сахаридные носители, пол и акрил амид и некоторые другие. Если замена носителя по какой-либо причине нежелательна, то используют следующий методический прием: отдаляют белковые молекулы от поверхности носителя за счет увеличения длины «ножки» (сшивающего агента). При этом, как правило, удается ослабить неблагоприятное для фермента воздействие носителя.
И наконец, третьей возможной причиной различия структур нативного и иммобилизованного ферментов может быть большое число связей между ферментом и носителем.
3, В принципе может реализоваться такая ситуация, когда в результате иммобилизации конформация фермента практически не изменяется, но нарушается динамика конформационных изменений в белке. Так, у белков, связанных с носителями, могут замедляться необходимые для катализа кенформационные переходы, уменьшаться число конформационных стадий и глубина их протекания. Причиной этого являются неспецифические взаимодействия функциональных групп белка с носителем. Чтобы избежать их, необходимо, как показывает практика, проводить иммобилизацию на инертных носителях.
Фиксация «напряженных» состояний фермента. Иногда исследователи целенаправленно стремятся «закрепить» с помощью иммобилизации конформацию фермента, отличающуюся от нативной. Это, в частности, оказывается важным для детекции конформационных изменений в ферментах, индуцированных субстратами, кофакторами и другими специфическими ли ганда ми,
: Рассмотрим» как это делается (рис. Н). Комплекс фермента с субстратом или другим специфическим лигандомt образующийся в присутствии насыщающих концентраций этого лиганда,
99
E-S
Рис, 14, Схематическое изображение фиксации с помощью иммобилизации «напряженной» конформации бедна,
сшивают бифунциональными агентами (стадия а на рис. 14) или присоединяют к предварительно активированному носителю (стадия б на рис. 14). После удаления лнгаида фермент остается зафиксированным в «напряженной» конформации.
Как показали многочисленные исследования, «замороженные» конформации фермента могут отличаться от обычных, ненапряженных состояний, реализуемых в тех случаях, когда иммобилизацию проводят в отсутствие специфических лигандов, ло целому ряду свойств: стабильности, доступности к действию модифицирующих агентов» сродству к субстрату и специфическим лигандам, а также каталитическим свойствам. Этот фактор необходимо учитывать, поскольку иммобилизацию фермента иногда рекомендуют проводить в присутствии специфических лнгандов с целью большей сохранности ферментативной активности.