Исследование фагоцитарной функции
Определение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа
Для оценки поглотительной и переваривающей активности лейкоцитов разработано большое число методик. Все они основаны на способности фагоцитов поглощать чужеродные частицы, входящие в состав тест-системы (конкретный вид микроорганизмов, зимозан, латекс — объект поглощения). Рекацию проводят in vitro или in vivo. Общий ход определения заключается в следующем: смешивают гепаринизированную или цитратную свежевзятую кровь (или суспензию фагоцитов) с равным объемом взвеси отмытой суточной микробной культуры (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E.coli, A. нydrophila) или другого объекта поглощения. Смесь осторожно перемешивают и помещают в термостат (37-40ºС — для теплокровных в зависимости от нормальной температуры организма, 26°С — для теплолюбивых рыб и более низкой для холодолюбивых). Через 15, 30, 45, 60 и 90 мин готовят мазки на предметных стеклах, высушивают, фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимза. Просматривают мазки под иммерсией и определяют фагоцитарную активность – процент фагоцитов, участвующих в фагоцитозе, фагоцитарный индекс – количество тест-микробов, захваченных одним фагоцитирующим лейкоцитом, фагоцитарное число – среднее число фагоцитированных объектов, приходящееся на 1 активный нейтрофил . Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет оценить динамику фагоцитоза. В норме через 90 мин фагоцитарный индекс должен быть ниже, чем через 45 мин и 60 мин, в связи с перевариванием микробов. При нарушении переваривания он не меняется.
Оценка функциональной активности фагоцитов по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)
Данный тест является показателем бактерицидной функции фагоцитов и позволяет оценить их способность к кислородзависимому киллингу. При задействовании этого механизма киллинга активируется фермент - НАДФ-оксидаза, который приводит к появлению в фагоците активных форм кислорода. Выброс таких веществ в клетке называется кислородный (респираторный) взрыв, который можно зарегистрировать с помощью НСТ-теста. При постановке этого теста к фагоцитам добавляют вещество нитросиний тетразолий, оно поглащается клеткой и в присутствии активных форм кислорода переходит в темно-синие окрашенное вещество — диформазан. Чем больше темно-синих гранул фиксируется на поверхности или внутри фагоцита, тем больше образовалось активных форм кислорода, тем сильнее кислородзависимый киллинг.
НСТ-тест ставят в двух вариантах: спонтанный и индуцированный. При постановке спонтанного НСТ-теста фагоциты культивируют в присутствии НСТ без предварительной активации клеток, при проведении индуцированного НСТ-теста в среду культивирования добавляют активатор фагоцитарной реакции. Постановка НСТ-теста в двух вариантах позволяет рассчитать функциональный резерв клеток, который представляет собой разницу между числом (интенсивностью) индуцированных диформазанпозитивных клеток и количеством (интенсивностью) спонтанных диформазанпозитивных клеток. Значения индуцированного НСТ-теста характеризуют активность фагоцитирующих клеток в присутствии антигенного раздражителя и рассматриваются как критерий их готовности к завершенному фагоцитозу. Спонтанный НСТ-тест позволяет оценить степень активации кислородзависимых механизмов киллинга неактивированных фагоцитов. Он характеризует степень активации внутриклеточных микробоцидных систем.
Для постановки спонтанного НСТ-теста к 0,1 мл крови добавляют 0,05 мл 0,2% раствора НСТ в калий-фосфатном буфере (0,1, рН 7,3) и 0,05 мл того же буфера. Параллельно ставят пробу для учета индуцированного НСТ-теста, в которую вместо 0,05 мл буфера добавляют такой же объем активатора фагоцитарной реакции (например, пирогенал вконцентрации 50 мкг/мл). Реакционную смесь термостатируют на водяной бане при 37 °С (30–60 мин). Готовят мазки средней плотности, высушивают на воздухе и фиксируют в этиловом спирте или смеси Никифорова (20 мин), после чего окрашивают водным раствором нейтрального красного (0,1%, 1 мин)
Мазки крови после постановки реакции микроскопируют под иммерсией (объектив 100×, окуляр 10×). Среди 100 клеток подсчитывают долю активированных нейтрофилов (ДАН, %), содержащих гранулы диформазана. По количеству отложившегося в клетках диформазана оценивают их активность в условных единицах и рассчитывают индекс активации нейтрофилов (ИАН, усл.ед.):
ИАН = (НСТотриц. ×0 + НСТ1× 1 + НСТ2×2 + НСТ3×3) / 100
где Нотриц. - количество клеток, не содержащих гранул диформазана;
Н1 — количество клеток, в которых площадь отложений диформазана менее 1/3 площади ядра;
Н2 — количество клеток, в которых отложения диформазана занимают от 1/3 до всей величины ядра;
Н3 — количество клеток, в которых отложения диформазана занимают больше площади ядра.
Выведение коэффициента мобилизации (КМ) осуществляют по следующей формуле:
ДАН (%) в индуцированном тесте
КМ = ---------------------------------------------------
ДАН (%) в спонтанном тесте