Определение титра специфических антител
Для определения титра специфических антител используют серологические реакции (то есть реакции, основанные на взаимодействии антиген-антитело).
Реакция агглютинации и ее варианты (РА). Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсорбированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, во второй - образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия). Избыток или недостаток антител препятствует проявлению агглютинации. Для постановки реакции агглютинации используют корпускулярные антигены (суспензии бактерий, эритроцитов). Пример: определение агглютининов в гемолимфе беспозвоночных животных.
Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РНГА, РПА). Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на клетках или частицах. В качестве сорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, частицы целлюлозы, бентонита или латекса. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, т.е. адсорбируют на эритроцитах или иных частицах не антигены, а антитела.
Реакция преципитации и ее варианты. Сущность данной реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена, находящегося в дисперсном коллоидном состоянии, воздействием специфических антител в растворе электролита. Механизмы реакций агглютинации и преципитации аналогичны и описываются теорией «решетки».
Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаружить малые количества антигена или гаптена. Высокая чувствительность реакции преципитации позволяет использовать ее для выявления антигенов с помощью известных антисывороток. В одном из вариантов последовательные разведения антигена наслаивают на стандартное разведение диагностической сыворотки в пробирках, при этом осадок образуется в виде кольца на границе двух сред (кольцепреципитация). Реакцию оценивают по максимальному разведению антигена, при котором наблюдается кольцо преципитации визуально. Кроме того, помутнение может быть зафиксировано инструментальными методами - нефелометрией и др.
Иммунодиффузия. Методы иммунодиффузии представляют собой вариант реакции преципитации, в которой взаимодействие антигена с антителами происходит не в жидкости, а в геле, что позволяет лучше выявлять и фиксировать результаты взаимодействия. В качестве геля чаще всего используется агаровый или полиакриламидный гель.
Существует несколько вариантов постановки реакций. Чаще всего используется метод двойной диффузии, при котором растворы, содержащие антигены и антитела, помещают в лунки, вырубленные в пластинке геля, находящегося на стекле. При экспозиции антигены и антитела диффундируют из лунок и на месте их встречи образуется полоса преципитации, хорошо видимая невооруженным глазом. Если в растворах содержалось несколько антигенных компонентов и соответствующие антитела, то они диффундируют в геле с разной скоростью и могут образовать несколько полос преципитации. Это позволяет выявить не только факт присутствия антигена, но и число составляющих компонентов. Взаимное расположение полос при помещении в соседние лунки сравниваемых антигенов дает возможность судить об идентичности составляющих их антигенов.
В другом варианте реакции раствор, содержащий антитела, смешивается с гелем до его застывания и помещения на стекло. Антиген помещается в лунку и при его диффузии в гель, содержащий антитела, образуется зона помутнения, диаметр которой пропоционален количеству антигена. Эта модификация метода, часто называемая по имени автора - метод Манчини, позволяет количественно определять антигены.
Реакция нейтрализации. Сущность метода реакции нейтрализации заключается в специфической способности нейтрализующих антител сыворотки крови подавлять способность вируса вызывать цитопатическое действие в культуре клеток. Для постановки реакции исследуемую сыворотку смешивают с раствором, содержащим антиген (вирус), затем полученную смесь вводят в культуру клеток. При наличии в сыворотке вируснейтрализующих антител цитопатогееное действие вируса не проявляется. Обычно используют ту культуру клеток, на которой выделяли вирус и к которой вирус уже адаптировался и проявляет четко выраженный инфекционный и цитопатогенный эффект. Например, для постановки реакции нейтрализации при исследовании на ИРТ используется перевиваемая линия культуры клеток MDBK (почка теленка), для ВД-БС — это культура клеток КСТ (коронарные сосуды теленка).
Иммуноферментный анализ (ИФА), предложенный в начале 70-х годов, основан на феномене конкуренции определяемого (немеченого) антигена с известным количеством меченого антигена, за ограниченное количество специфических к антигену антител, введенных в систему. Чем больше в исследуемой жидкости содержится определяемого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами и, следовательно, больше останется в растворе. В качестве метки используют фермент (пероксидаза, щелочная фосфотаза, глюкозооксидаза и др.). Количество меченых антигенов или антител, вступивших в реакцию, определяют на основании изменения окраски субстрата под влиянием этого фермента. Варианты осуществления иммуноферментного анализа - гомогенный и гетерогенный варианты. Гомогенный иммуноферментный анализ, который используют для определения низомолекулярных веществ, основан на различии активности фермента в зависимости от характера его связывания (например, подавление активности в результате связывания с гаптеном и восстановление ее после реакции антиген-антитело). При гетерогенном иммуноферментном анализе антиген или антитело иммобилизуется на твердой фазе. В качестве твердой фазы обычно используют пластик – лунки планшетов для иммунологических реакций. Основные варианты техники гетерогенного иммуноферментного анализа (техники ELISA): конкурентный тест с использованием меченых антигенов и антител и неконкурентные тесты, к которым относятся метод двойных антител (сэндвич – метод) и непрямой метод.
Сущность метода двойных антител состоит в следующем. Антитела фиксируют на твердой фазе, для чего инкубируют их в лунках планшета из полистирола с последующей отмывкой несвязавшихся антител. Затем в лунки добавляют растворы анализируемого или стандартного антигена, инкубируют, отмывают. После отмывки в лунки приливают избыток меченных ферментом антител (эти антитела должны принадлежать к животному другого вида, чем иммобилизованные), несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием. На последнем этапе анализа в лунки добавляют субстрат, который под влиянием фермента превращается в окрашенный продукт реакции. Количество этого продукта (а значит, и интенсивность окраски) пропорционально количеству связавшихся с антигеном конъюгатов антитело – фермент. Степень окраски раствора измеряют фотометрически (используя специальные спектрофотометры-ридеры, позволяющие измерять поглощение света в пробах, находящихся непосредственно в планшетах).
Для определения антител часто используют непрямой метод, смысл которого состоит в том, что в лунках иммобилизуют антиген, затем инкубируют его с пробой, содержащей исследуемые антитела, затем, после отмывки, обрабатывают конъюгатом антиглобулин-фермент, после чего добавляют субстрат и измеряют количество продукта реакции.
Одной из наиболее распространенных инфекционных болезней телят молочных и мясных пород, выращиваемых при интенсивном типе ведения животноводства, является бронхопневмония смешанной этиологии. Заболеваемость может составлять 100%, летальность 20-50%. Во время массовой вспышки респираторных болезней телят в крупном хозяйстве по производству молока экономические потери могут достигать 4 млн.руб. из-за гибели телят, отставания в росте и недополучения приростов в группе переболевших животных, затрат на лечебные мероприятия.
Значительное распространение получила смешанная инфекция, вызываемая вирусами инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек КРС. Опасность этих болезней обусловлена их способностью вызывать репродуктивные нарушения и острые формы инфекции с иммуносупрессией. При инфицировании коров происходят аборты, рождается слабый, нежизнеспособный и часто инфицированный молодняк. В крупных молочных стадах циркуляция вирусов практически непрерывна, что обуславливает постоянный риск возникновения пневмонии у телят. Поэтому важно, чтобы и взрослое маточное поголовье, и молодняк имели высокий уровень иммунитета к данным болезням. Напряженность иммунитета к возбудителям вирусных болезней у взрослых животных оценивают по уровню специфических антител в сыворотке крови, которые обеспечивают устойчивость к инфекционным болезням, у молодняка по уровню также колостральных специфических антител и по количеству иммуноглобулинов (естественная резистентность). Мерой напряженности иммунитета служат титры антител. Титром называют максимальное разведение сыворотки, при котором в ходе лабораторного исследования ещё наблюдается реакция антиген-антитело. Например, для защиты от экспериментальной болезни, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС, требуются титры пассивных антител не ниже 1:8. Чем больше животных в стаде (популяции) имеет напряженный иммунитет (то есть иммунитет с защитным уровнем сывороточных антител), тем меньше риск вспышки болезни и отрицательных её последствий.