6.6.2. Неконкурентное ингибирование

Не может быть ослаблено увеличением концентрации субстрата. Ингибитор связывается на участке, отличном от центра связывания субстрата. Может связываться либо со свободным ферментом, либо с комплексом ES, либо с тем и другим. Обе формы EI и ESI неактивны. Также легко распознается на графике. Не имеют общей точки на оси ординат, отсекаемый отрезок для ингибированного фермента больше, чем для неингибированного, что указывает на понижение значения V_max , устранить уменьшение V_max добавлением субстрата невозможно.

Наиболее общий тип неконкурентного ингибирования - при действии реагентов, обратимо связывающихся -SH группами остатков цистеина (например, ионы тяжелых металлов: Cu⁺², Hg⁺², Ag⁺ - образуются меркаптиды). Устанавливается равновесие меркаптидной формы фермента со свободным ионом металла. Не только в случае нахождение группы в каталитическом центре. Если далеко - изменение пространственной структуры белка.

Ферменты, требующие для своей активности наличия металлов неконкурентно ингибируются соединениями, связывающими эти металлы. Напр. требующие Fe⁺² или Fe⁺³неконкурентно ингибируются цианидами (образование ферро- или феррицианида). Широко используется в биохимии ЭДТА (этилендиаминотетраацетат) - связывает двухвалентные катионы - неконкурентный ингибитор ферментов, требующих эти ионы.

Наиболее важные неконкурентные ингибиторы – промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться со специфическими участками некоторых регуляторных ферментов и изменять при этом их активность.

6.6.3. Необратимое ингибирование. Модификация ферментов

.

Если ингибитор связывается необратимо, то ТММ неприменима. Взятый в превышающей эквимолярную концентрации ингибитор может не давать сразу полного ингибирования, но со временем степень ингибирования будет нарастать - все больше молекул фермента будет взаимодействовать с ингибитором. Другой вариант - ингибитор химически модифицирует молекулу, снижая ее активность, но не устраняя полностью. Для выявления такого типа ингибирования нужны спецметоды.

Широко известный необратимый ингибитор - алкилирующий агент йодацетамид (и другие алкилирующие). Необратимо реагирует с SH группами. Равновесие сильно сдвинуто вправо:

E-SH + ICH₂CONH₂ → E-S-CONH₂ + HI

6.7. Регуляция активности ферментов

Ферменты организованы в последовательные цепи или системы – 15 и более. В каждой цепи есть хотя бы один, определяющий активность всей цепочки, т.к. он катализирует лимитирующую (самую медленную) стадию. Эти ферменты обладают способностью повышать или понижать свою активность в ответ на определенные сигналы. Благодаря им происходит постоянное подстраивание всей системы под нужды организма. В большинстве мультиферментных систем такой т.н. регуляторный фермент катализирует первую стадию цепи. Остальные – способны работать с гораздо большей скоростью. Обычно регуляторные ферменты:

1. Крупнее и сложнее, большинство из 2 и более субъединиц;

2. Кинетика значительно отличается от ТМТ, по этому признаку и были впервые обнаружены.

2 основных класса регуляторных.

Аллостерические ферменты регулируются нековалентно связанными с ними модуляторами. На примере бактериальной треонингидратазы, первого фермента в цепи превращения L-треонина в L-изолейцин.

Обратимо ингибируется изолейцином, не ингибируется ни одним из промежуточных продуктов. Ни один другой фермент не ингибируется изолейцином. Повышение концентрации конечного продукта – специфическое связывание с треонингидратазой – замедление всей системы. Ингибирование по принципу обратной связи или ретроингибирование. Связывается не с активным центром, а с другим участком фермента, называемым регуляторным центром. Связывание нековалентное – легко обратимо. Аллостерические – «имеющие другое место».

Регуляторный метаболит – эффектор или модулятор. Могут быть как отрицательные, так и положительные. То есть, существуют ферменты, которые активируются не продуктом, а каким-то другим метаболитом, свидетельствующим о том, что реакцию надо ускорить. В качестве положительного модулятора может выступать субстрат (т.н. гомотропные аллостерические ферменты). Для таких центр может выполнять двойную функцию: и каталитическую и аллостерическую.

Существуют ферменты, имеющие одновременно как положительные, так и отрицательные модуляторы. Для каждого модулятора – свой центр связывания.

Второй класс регуляторных ферментов – у которых переход из неактивной формы в активную происходит путем ковалентной модификации. Модификация может осуществляться за счет:

1. фосфорилирования – дефосфорилирования;

2. частичного протеолиза;

3. ассоциации – диссоциации.

Пример ковалентной модификации фосфорилированием: гликогенфосфорилаза мышц и печени:

(глю)_n + Р → (глю)_n-1 + глю-1-фосфат

Гликогенфосфорилаза существует в двух формах: фосфорилаза а (активная форма) и фосфорилаза b (относительно неактивная).

Каждая молекула фосфорилазы а состоит из двух идентичных субъединиц, каждая из которых содержит по остатку серина, фосфорилированного по гидроксильной группе. Фосфаты удаляются с помощью фосфатазы фосфорилазы, фермент переходит в форму b. Обратная реакция – киназой фосфорилазы, фосфат переносится от АТФ.

Фосфорилированная форма гликогенсинтетазы (фермента, катализирующего обратную реакцию) неактивна («b»). Когда происодит синтез гликогена, его распад ингибируется и наоборот.

В большинстве известных случаев регуляция ковалентной модификацией происходит через фосфорилирование, однако возможны и метилирование, перенос аденилатной группы и т.д.

Некоторые ферменты первоначально синтезируются в клетке в неактивной форме (проферменты или зимогены). Аминокислоты, образующие активный центр присутствуют, но не расположены должным образом. После доставки профермента к мишени отщепляется часть полипептидной цепи, изменяется трехмерная структура и формируется активный центр. Пример: пепсин-пепсиноген. Защита собственных тканей от протеолиза.

Некоторые ферменты-олигомеры могут изменять активность за счет ассоциации-диссоциации протомеров, входящих в их состав. Пример: протеинкиназ – олигомер, состоящий из 4 протомеров двух типов: каталитических и регуляторных. В ассоциированном виде фермент неактивен: каталитический центр закрыт регуляторной субъединицей. Повышение цАМФ – связывание с регуляторной субъединицей – диссоциация олигомеров – активация фермента.

Некоторые сложные ферменты модулируются как аллостерически, так и ковалентно. Они катализируют наиболее важные этапы метаболизма и взаимодействуют со многими метаболитами.

Клетки способны регулировать синтез своих собственных катализаторов. Так, клетка способна “выключать” синтез ферментов, необходимых для производства данного продукта из его предшественников, всякий раз, когда она получает эти продукты из внешней среды.

---- ингибирование

----компартментализация

По международному соглашению за единицу ферментативной активности принимается количество фермента, способное вызывать превращение одного микромоля субстрата в мин при 25⁰С в оптимальных условиях. Удельная активность - число единиц ферментативной активности в расчете на 1 мг белка - критерий чистоты препарата. Под числом оборотов - число молекул субстрата, подвергающееся превращению в единицу времени в расчете на одну молекулу фермента (или на один активный центр) в условиях, когда скорость реакции лимитируется концентрацией фермента. Из всех известных - максимальное у карбоангидразы - 36 000 000 в мин (β-Амилаза - 1 100 000, β-галактозидаза - 12500, сукцинатдегидрогеназа - 1150).