50. Применение спектрофотометрии в точной колориметрии.

Основное применение спектрофотометров в лаборатории — точ­ная колориметрия, т. е. измерение количества хромофора, образую­щегося в ходе реакции. Многие соединения, слабо поглощающие в види­мой области, после реакции с другими веществами дают окрашен­ные продукты, количество которых однозначно связано с концен­трацией исходного вещества. Такую цветную реакцию используют для обнаружения этих веществ. При некоторых стандартных усло­виях и определенных концентрациях вещества проводят реакцию, а затем измеряют поглощение смеси. В качестве сравнения исполь­зуют ту же смесь, но без исследуемого вещества. При помощи этого контрольного образца изменением щели устанавливают нулевое значение экстинкции. После ряда измерений строят график зави­симости поглощения образца от концентрации исследуемого вещест­ва. Теперь, когда нужно определить количество вещества, в стан­дартных условиях проводят реакцию, измеряют поглощение образ­ца и по градуировочной кривой определяют концентрацию исход­ного вещества. В биохимии этот способ применяется довольно час­то, поскольку во многих случаях удается подобрать такие реакции, когда незначительные количества вещества дают сильное окраши­вание.При их проведении необходимо помнить следующее.

1.         Измерение поглощения следует проводить в дополнительной для цветной реакции области спектра. Так, если при реакции рас­твор окрашивается в желтый цвет, нужно измерять поглощение этим раствором синего света.

2.         Исследовать цветную реакцию лучше всего в максимуме по­глощения — этим достигается наибольшая чувствительность. Если положение максимума неизвестно, его следует определить. Такие предосторожности гарантируют получение хороших результатов даже на малочувствительном приборе.

3.         В кювете с контрольным раствором обязательно должны содержаться все компоненты, кроме исследуемого вещества.

4.         Контрольный раствор должен быть приготовлен очень тща­тельно, поскольку от этого зависит получение правильных резуль­татов.

5.         Если зависимость линейна, для получения хорошей градуи- ровочной кривой нужно не менее пяти точек. Для нелинейной кри­вой их нужно существенно больше. Построение градуировочной кривой позволяет исключить точки, поглощение для которых полу­чено ошибочно.

6.         Измерение концентрации необходимо проводить дважды, и на кривую наносить оба значения, а не их среднюю величину. Такой способ построения наглядно показывает точность определе­ния концентрации по полученной градуировочной кривой. Кроме того, он позволяет сразу обнаружить неправильные измерения по их сильному отклонению от кривой.

7.         Калибровочные кривые, полученные с реагентами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реагента градуировочную кривую надо получить заново.

8.         Наилучшая кривая, проведенная по всем экспериментальным точкам, не обязательно должна точно проходить через нуль. Это связано с тем, что для поглощающего контрольного раствора прак­тически невозможно получить точно такое же соотношение всех компонентов, как для образца.