20. Методы анализа днк. Днк-диагностика наследственных заболеваний.

К методам, широко используемым при изучении генетики человека, относятся генеалогический, популяционно-статистический, близнецовый, метод дерматоглифики, цитогенетический, биохимический, методы генетики соматических клеток.

Генеалогический метод - составление и анализ родословных. Обычно это или больной, или носитель определенного признака, наследование которого необходимо изучить.

С помощью метода установляется наследственная обусловленность изучаемого признака, тип его наследования. При анализе родословных по нескольким признакам выявляется сцепленный характер их наследования, что используют при составлении хромосомных карт. Метод позволяет изучать интенсивность мутационного процесса, оценить экспрессивность и пенетрантность аллеля. Используется в медико-генетическом консультировании для прогнозирования потомства. Генеалогический анализ существенно осложняется при малодетности семей.

Близнецовый метод. Этот метод заключается в изучении закономерностей наследования признаков в парах одно- и двуяйцевых близнецов.

ДНК - диагностика

Молекулярная диагностика наследственной патологии

В настоящее время молекулярная диагностика является золотым стандартом для целого ряда специальностей.

• Инфекционные заболевания и эпидемиология.

• Бактериология

• Судебная медицина (определение отцовства)

I МЕТОД Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Создатель методики - Кэрии Муллис (1993 - нобелевская премия).

ПЦР позволяет быстро накопить болшое количество копий изучаемого участка ДНК. Это позволяет увеличить чувствительность диагностичских методов и увеличить точность диагностики. Пэтому ПЦР может применяться на подготовительном этапе перед другими методами диагностики.

Компоненты ПЦР:

1. образец изучаемой ДНК. ДНК из исследуемого материала можно выделить с помощью фенола и хлороформа. Еще ДНК выделяют с помощью спец. наборов реактивов

2. термофильная ДНК-полимераза. Этот фермент был выделен из бактерий, которые обитают в горячих источниках. Активность этого фермента регулируется температурой среды, фермент работает при температуре 60-70 градусов.3. Праймеры. Короткие фрагменты ДНК , которые искусственно синтезируют. Они ограничивают с двух сторон (фланкируют) изучаемый участок ДНК.

4. Нуклеотиды

5. Соли магния (без них не работает ДНК-полимераза)

Этапы ПЦР:

1. Выделение ДНК из исследуемого маериала

2. Сборка реакционной смеси (в определенную пробирку вносят все компоненты реакции). Необходимо избегать загрязнения реакции посторонней ДНК (избегать контаминации). Чтобы избежать, нужно стирильное оборудование, одежда, пречатки, маска, ламинарный шкаф.

3. Проведение собственно ПЦР. Используется спец. прибор термоциклер. Этот прибор по заданной программе точно регулирует температуру реакционной смеси

Ход реакции:

а) денатурация ДНК. Происходит разрушение водородных связей между цепями ДНК. Температура 92-95 градусов, 10 секунд

б) Отжиг праймеров. Праймеры по принципу комплементарности прикрепляются к соответствующим участкам ДНК, которые с 2 сторон ограничивают изучаемы фрагмент ДНК. Температура 30-50 градусов, 20-30 секунд.

в) синтез ДНК. Активируются ДНК-полимераза и начиная от праймера синтезирует нужный фрагмент ДНК. Длина синтезированного участка зависит от длительности этапа. Температура 65-70 градусов, 30-40 секунд

.

Цикл многократно повторется и каждый раз удваивается количество нужного фрагмента ДНК.

Способы детекции результатов генетического анализа:

1. Электрофорез.

Проводится В специальных кюветах, они заполняют полиакрил амидным гелем, затем социальным пробойником в Геле делают лунки. В лунки помещают изучаемую днк и подключают постоянный ток на определенное время. Под действием тока ДНК двигается к положительному к полюсу. ДНК дисоциирует и теряет протон. Скорость движения фрагмента ДНК зависит от ее массы, то есть, чем больше масса, тем ниже скорость и фрагмент проходит меньшее расстояние. Таким образом, с помощью электрофореза можно разделить фрагменты ДНК. После завершения Электрофореза препарат обрабатывают этидом бромидия. Окрашенная ДНК под действием ультрафиолета дает красное свечение. При необходимости используют стандартные образцы ДНК с фрагментами известной массы.

2. ДНК-зонды. Это короткие искусственно синтезированные фрагменты ДНК, они комплементары к определенным участкмм изучаемой ДНК( к прмотору,к экозону и т.д.).

Для обнаружения, ДНК зонды обрабатывают специальными метками:

1.Радиоактивные изотопы ( сегодня используют редко)

2.Флюорохромы - красители, которые дают свечение под действием уфо. Зонд связывается по принципу комплементарости с мишенью в модуле ДНК (происходит гибридизация).

В качестве примера рассмотрим метод FISH (флюроисцеин ин ситу гибридизация) - позволяет работать с целыми биологическими объектами:

1. Исследуемый материал наносят на носители(стекло).

2. Производят денатурацию ДНК(с помощью щелочи)

3. Добавляют ДНК зонды и инкубируют определенное время (за это время происходит гибридизация,то есть, зонд фиксируется к мишени в молекуле ДНК.

4.Затем, препарат промывают, чтобы удалить несвязавшихся ДНК зондов.

5. Изучение препарата в люминесцентном микроскопе.

6.При положительной реакции обнаруживаются светящиеся объекты.

3. Рестрикционный анализ:

Используются специальные ферменты рестриктазы (каждая рестриктаза способна разрезать цепь ДНК в строго определенном месте или в сайте рестрикции). Сайт-это определенныйо набор нуклеотидов. В настоящее время выделено очень большое количество разных рестриктаз. У каждой рестриктаза свой сайт рестрикции.

В качестве примера рассмотрим ПДРФ анализ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов):

1. Проводят ПЦР для накопления изучаемого материала.

2. Полученную ДНК обрабатывают рестриктазой

3. Электрофорез

4. Анализ расположения фрагментов ДНК.