60—70 остатков, сигналузнающая US рибонуклеопротеидная частица (SRP) присоединяется к рибосоме и останавливает элонгацию. Эта остановка трансляции продолжается до тех пор, пока не осуществится контакт с «причальным белком» (его цитоплазматическим доменом) мембраны эндоплазматического ретикулума. Элонгация теперь восстанавливается, и растущий пептид входит, по мере роста, непосредственно в мембрану (ко-трансляционная транслокация пептида через мембрану).

Следует подчеркнуть, что остановка элонгации по выходе сигнальной последовательности из рибосомы представляется очень важной для нормальной секреции (или вхождения в мембрану) синтезируемого белка. В самом деле, если бы не было остановки, то продолжающаяся элонгация могла бы привести к дополнительному сворачиванию торчащего растущего пептида в водной фазе

клетки и, как результат, «упрятыванию»		сигнальной последователь-
ности; это сделало бы невозможным		его	узнавание	мембраной
и последующую секрецию.	Следовательно,		остановка	элонгации
обеспечивает необходимое	«ожидание»	сигнальной последователь-

ности в нужной экспонированной конформации для «причаливания» к мембране.

Отщепление сигнальной последовательности у люминальной стороны мембраны, обращенной в межмембранный просвет эндоплазматического ретикулума, по-видимому, приводит к тому, что

гидрофобность растущего пептида	уменьшается, и его пребывание
в липидном бислое становится	менее выгодным, чем переход

в водную фазу межмембранного просвета. Соответственно, в зависимости от аминокислотного состава и последовательности, в водную фазу будут вытолкнуты либо лишь его водорастворимая часть (скажем, N-концевая часть), как в случае многих трансмем-

бранных белков, либо весь белок	по завершении его синтеза, как
в случае секретируемых белков.	Естественно, переход в водную

фазу должен сопровождаться перестройкой пространственной структуры, приобретающей глобулярную конформацию (гидрофобные остатки обращаются внутрь глобулы или глобулярного домена, в то время как гидрофильные экспонируются наружу).

Секреторные белки, накапливающиеся в межмембранном просвете (цистерновом пространстве) эндоплазматического ретикулума, далее транспортируются к аппарату Гольджи, концентрируются в секреторных гранулах и, наконец, выводятся посредством механизма экзоцитоза.

3. КО-ТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКА

Вылезание растущего пептида из рибосомы и его ко-трансляцион- ное сворачивание в водной среде или прохождение через мембрану сопровождается большими или меньшими энзиматическими модификациями цепи.

В прокариотах, а также в митохондриях и хлоропластах эукарио-

285

тических клеток синтез любого	пептида на рибосоме начинается
с формилметионинового остатка (гл. В. VI). Однако в готовых
белках формильная группа не	обнаруживается, а метионин явля-

ется N-концевым остатком	только у части белков. Оказалось, что
в прокариотической клетке	(так же как и в митохондриях и хлоро-

пластах) существует специальная деформилаза, которая гидролитически отщепляет формильную группу от концевого метионина вскоре после появления N-конца растущего пептида из рибосомы.

В прокариотах и в эукариотах существует также метионинспецифическая аминопептидаза, способная отщеплять N-концевой метионин, но ее срабатывание зависит, по-видимому, от ко-трансляционного сворачивания растущего пептида. Во всяком случае, в некоторых белках N-концевой метионин сохраняется, и происходит это, как считают, в результате его недоступности из-за каких-то конформационных особенностей N-концевой части растущего пептида.

Выше уже говорилось о ко-трансляционном протеолитическом отщеплении сигнальной гидрофобной последовательности ряда секреторных и трансмембранных белков эукариот. Сигнальная пептидаза локализована в мембране на ее стороне, обращенной от цитоплазмы (т. е. на люминальной стороне мембраны эндоплазматического ретикулума эукариотической клетки). По типу действия она оказалась эндопептидазой. Характерным местом расщепления полипептидной цепи сигнальной пептидазой.является пептидная

связь у малого остатка, такого	как	С1у	или	Ala,	реже	Ser или
Cys, с его С-стороны (часто, но далеко			не всегда, за ним сле-
дует заряженный остаток, такой	как	Arg,	Lys,	His,	Asp).	Кроме

того, район расщепления должен быть как-то отмечен более открытой конформацией пептида в этом месте. Отщепление

сигнального пептида —необходимая предпосылка для	последующего
выхода растущего пептида в водное замембранное	пространство
и его ко-трансляционного сворачивания там.

Очевидно, что важную роль в ко-трансляционном сворачивании белка может играть образование дисульфидных связей между цистеиновыми остатками. Дисульфидные связи, скрепляющие третичную структуру, особенно распространены у секреторных белков эукариот. Наоборот, внутриклеточные белки чаще характеризуются свободными сульфгидрильными группами цистеиновых остатков. Действительно, условия внеклеточной среды, по сравнению с внутриклеточной, являются более окислительными. Дисульфидные связи, по-видимому, могут завязываться между цистеиновыми остатками растущей полипептидной цепи уже по мере ее прохода через мембрану в межмембранный просвет. Такие связи могут возникать спонтанно при достаточно окислительных условиях среды. Однако, во-первых, скорость спонтанного образования дисульфидных связей в белке, по сравнению со скоростью его синтеза и сворачивания, не велика; во-вторых, в процессе сворачивания всегда существует вероятность образования дисульфидных связей между не теми остатками цистеина, которые должны образовать мостики в законченной свернутой белковой молекуле. Более 20 лет назад

286

было открыто, что в эндоплазматическом ретикулуме животных клеток содержится фермент, катализирующий образование дисуль-

фидных связей	в белках. На самом деле, ускоряя как прямую,
так и обратную	реакцию, фермент катализировал тиол-дисульфид-

ный обмен, тем самым приводя не только к быстрому образованию дисульфидных связей, но и к быстрой замене неправильных или промежуточных (ненативных) связей на правильные в ходе сворачивания белка. Таким образом, фактически катализировался процесс сворачивания дисульфидсшитых белков. Фермент может быть обозначен как дисульфидизомераза белков. Он очень лабильно ассоциирован с люминальной поверхностью мембраны, обращенной в межмембранный просвет эндоплазматического ретикулума, и не исключено, что он может присутствовать в межмембранном просвете в растворимой форме. Можно думать, что в процессе синтеза белка и выхода растущей полипептидной цепи в межмембранный просвет дисульфидизомераза катализирует ко-трансляционное образование внутридоменных дисульфидных связей и их перебор в ходе формирования правильной третичной структуры высунувшегося домена.

Один из наиболее важных и интересных типов ко-трансляцион- ной модификации — первичное, или так называемое «сердцевинное» N-гликозилирование некоторых аспарагиновых остатков растущих цепей ряда трансмембранных и секретируемых белков в мембранах эндоплазматического ретикулума эукариотических клеток. N-гликози- лирование представляет собой перенос углеводной (олигосахаридной) группы от полипренольного липида мембраны —долихилдифос- фата —на амидную группу аспарагинового остатка растущего пептида. Общая схема процесса выглядит так. Долихилфосфат

СНз	СНз	СНз	О-
I	I		I I
СНз - С -	СН - СН2 - (СН2 - С - СН - CH2)i6 - is -	СНа - С - СН - СН2	- О - Р - О
			I
			о-

представляет собой мембраносвязанный липидный акцептор, на котором строится олигосахаридная группа. Сначала долихилфосфат, реагируя с уридиндифосфат-1Ч-ацетилглюкозамином (UDP-GlcNAc), акцептирует остаток N-ацетилглюкозаминфосфата:

Dol—(?) + UDP—GlcNAc *- Dol—(?)—(Г)—GlcNAc + UMP

В следующей реакции добавляется еще один остаток N-ацетил- глюкозамина:

Dol—(Р)—(?)—GlcNAc + UDP—GlcNAc »- Dol-

Затем в серии последовательных реакций гликозилированный долихилдифосфат реагирует с гуанозиндифосфатманнозой (GDPМап), в результате чего на первых углеводных остатках наращивается разветвленный полиманнозид:

Dol—(?)—(?)—GlcNAc2 + nGDP—Man

»-

»-Dol—(?)—(?)—GIcNAcj—Mann + nGDP

287

Наконец, к нему от уридиндифосфатглюкозы (UDP-Glc) добавляются еще остатки глюкозы:

Dol-P

Dol—(P)—(P)—GlcNAcj-Mann+ 3UDP—Glc

*^Dol—(?)—(?)—GlcNAc2 —Mann —Glc3 + 3UDP

Именно этот олигосахарид и переносится соответствующей гликозилтрансферазой на аспарагиновый остаток растущего пептида:

Dol—(?)—(?)—GlcNAc2 —Mann —Glc3 + (Asn)protein

* - Glc3—Mann—GlcNAcj—(Asn) protein + Dol—(£,

Вслед за этим глюкозные остатки частично удаляются гликозидазами. Однако в завершенных белках такой олигосахаридной структуры, как правило, не встречается. Оказывается, эта структура представляет лишь промежуточную в общем процессе N-гликозилирования белка. Дело в том, что вслед за описанным ко-трансляционным этапом следует посттрансляционный этап, который осуществляется в основном по поступлении синтезированного белка в аппарат Гольджи.

Посттрансляционный этап приводит к удалению

глюкозы

и

последовательному

частичному

отщеплению

остатков маннозы,

а

затем часто к добавлению остатков N-ацетилглюкозамина,

галакто-

зы и

сиаловой

кислоты,

а

иногда

также

фукозы

и

ксилозы;

в конце концов

получается

разветвленный

гетероолигосахаридный

остаток, присоединенный к амидной группе аспарагина

соответствую-

щего готового

белка.

У

грибов

ко-трансляционное гликозилирование

на

мембране

с участием долихилфосфата может идти не только по

аспараги-

новым остаткам (N-гликозилирование),

но

и

по остаткам серина

и треонина (О-гликозилирование). В этом случае сначала

долихил-

фосфат акцептирует

остаток маннозы от гуанозиндифосфатманнозы:

Dol—(?) + GDP—Man

**- Dol—(?)—Man + GDP

Остаток маннозы соответствующей гликозилтрансферазой . переносится на оксигруппу серина или треонина растущей пептидной цепи:

Dol—(?)—Man + (Ser/Thr) protein

* - Man—(Ser/Thr) protein + Dol—(?)

Уже после завершения трансляции, в аппарате Гольджи другая гликозилтрансфераза наращивает углеводный остаток пептидной цепи еще несколькими остатками маннозы, перенося их от гуанозиндифосфатманнозы:

GDP-Man + Man-(Ser / Thr) protein -

• Mam-з -Man-(Ser / Thr) protein + GDP

О-гликозилирование белков по остаткам серина и треонина в животных и растительных клетках идет по другому механизму. Оно всегда, по-видимому, является лишь посттрансляционным процессом и происходит в аппарате Гольджи.

288