могут воздействовать либо как на начальную дискриминацию амино- ацил-тРНК, так и на стадию коррекции, либо в некоторых случаях избирательно изменять именно корректирующую функцию рибосомы.

Запирание аминоацил-тРНК в А-участке

В целом ряде независимых экспериментов были получены данные о том, что после гидролиза ГТФ и освобождения EF-TU • GDP из рибосомы аминоацил-тРНК еще до стадии транспептидации оказывается запертой в А-участке. Это и есть окончательная фаза связывания с А-участком — полное связывание с А-участком (рис. 99, реакция 5).

Можно строить различные гипотезы о механизме такого запирания, но его трудно представить без конформационной перестройки тРНК или рибосомы. Одна из возможных гипотез состоит в том, что в 70S рибосоме А-участок не строго фиксирован, а доформируется в процессе кодонзависимого связывания аминоацил-тРНК путем подстройки 30S и 50S субчастиц. Например, уход крупного белка EF-TU мог бы позволить осуществиться более тесному смыканию («притягиванию») 50S субчастицы к аминоацильному концу аминоацил-тРНК и к 30S субчастице, что вызвало бы как раз запирание аминоацил-тРНК.

Общая схема

Итак, аминоацил-тРНК в ходе энзиматического связывания с мРНКпрограммированной рибосомой проходит целый ряд последовательных фаз (рис. 99). Вопрос о том, что называть А-участком — лишь положение окончательного (запертого) связывания аминоацил-тРНК, рассматривая предыдущие положения связываемой тРНК как серию последовательных перекрывающихся участков предварительного связывания, или же область рибосомы, в пределах которой возможны разные промежуточные состояния связывания аминоацил-тРНК, — носит скорее терминологический характер. Ясно, что во всяком случае при переходе от фазы к фазе некоторые контакты аминоацил-тРНК с рибосомой могут несколько меняться, но перераспределения на неперекрывающиеся участки нет. Здесь вся совокупность различных возможных перекрывающихся положений аминоацил-тРНК в процессе связывания с рибосомой рассматривается в терминах единого А-участка, с разными состояниями связывания в нем.

Общая схема последовательности событий, описанная выше, дана на рис. 100.

Рекомендуемая литература

Биологическое воспроизведение макромолекул: Пер. с англ. / Под ред. В. Л. Рыжкова. М.: ИЛ, 1960. С. 209-246.

Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ. Сер. биол. химия, 1983. С. 5-193.

Кемхадзе К. Ш., Одинцов В. Б., Махно В. И. и др. Механизм кодон-антикодонового взаимодействия в рибосомах. Взаимодействие аминоацил-тРНК с 70S рибосомами Escherichia соЧ в отсутствие фактора элонгации EF-TU и GTP. — Молекул, биол., 1981. Т. 15. С. 779-789.

Руткевич Н. М., Гаерилова Л. П. Рибосомный синтез полилейцина на полиуридило-

181

Aa-tRNAEF-Tu-GTP

(1) СКАНИРОВАНИЕ

КОРОТКОЖИВУЩИИ

КОМПЛЕКС

(2) УЗНАВАНИЕ

(3)ГИДРОЛИЗ ГТФ

А\

-^ р.

(СТАДИЯ КОРРЕКЦИИ)

(4) ОСВОБОЖДЕНИЕ EF-TU

EF-TUGDP

(СТАДИЯ ЗАПИРАНИЯ)

Рис. 100. Схема последовательности событий в процесс связывания аминоацил-тРНК с рибосомой

182

вой кислоте как матрице в

бесклеточной

системе

трансляции. — Докл.

АН

СССР,

1980. Т. 254, № 3. С. 766-768.

Шварц В. С, Лысиков В. Н. Физические механизмы «рибосомального сита».—Докл.

АН СССР, 1974. Т. 217, № 6. С.

1446-1448.

The Mechanism

of

Protein

Synthesis. - Cold Spring Harbor

Syrap. Quant. Biol.,

1969,

v. 34, p. 321-344; 377-384; 419-462.

Chambliss

G.

et

al.,*eds.

Ribosomes: Structure, Function, and Genetics. Baltimore:

Univ. Park Press, 1980, p. 377-444; 555-581; 585-638.

Cohn W. E., ed. Progress

in

Nucleic

Acid

Research

and

Molecular

Biology.

N.

Y.:

Acad. Press, 1978, v. 21, p. 63-100.

Nomura

M.,

Tissieres

A.,

Lengyel P.,

eds.

Ribosomes.

N.

Y.:

Cold

Spring

Harbor

Laboratory, 1974, p. 871-884.

Sundaralingam

M., Rao

S.

Т., eds. Structure and Conformation of Nucleic Acids and

Protein-Nucleic Acid

Interactions. Baltimore: Univ. Park Press, 1975, p. 101-115.

Weissbach И., Pestka S., eds. Molecular Mechanisms of Protein Biosynthesis.

N. Y.:

Acad. Press, 1977, p. 7-79; 323-373; 467-555.

Chapeville

F.,

Lipmann

F.,

von

Ehrestein G.

et

al. On the

role

of

soluble

ribonucleic

acid in coding for amino acids. - Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A.,

1962,

v.

48, p.

1086-1092.

Crick F. H. С

Codon-anticodon pairing:

The

wobble

hypothesis. - J.

Mol.

Biol.,

1966,

v. 19, p. 548-555.

Davies J. E., Gilbert W., Gorini L. Streptomycin, suppression,

and

the code. -

Proc. Nat.

Acad. Sei. U.S.A.,

1964, v. 51, p. 883-890.

Edelman P., Gallant J. Mistranslation in E. coli. -

Cell, 1977, v. 10, p. 131-137.

Eisinger J., Gross N. The

anticodon-anticodon

complex. -

J.

Mol.

Biol.,

1974,

v.

88,

p. 165-174.

Gavrilova L. P., Perminova I. N., Spirin

A.

S.

Elongation

factor

T u

can

reduce

translation errors in poly(U)-directed cell-free

systems. - J.

Mol. Biol., 1981, v. 149, p.

69-78.

Goodman H. A/., Abelson J., Landy A. et al. Amber

suppression: A

nucleotide

change

in the anticodon of a tyrosine transfer RNA. - Nature, 1968, v. 217, p.

1019-1024.

Gorini

L.

Ribosomal

discrimination

of

tRNAs. - Nature

New

Biol.,

1971, v.

234,

p. 261-264.

Hopfleld J. J. Kinetic proofreading: a new mechanism for reducing errors in biosynthetic

processes requiring

high specificity. .- Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A.,

1974, v: 71, p. 4135-4139.

Lagerkvist

U. «Two out of

three»: An alternative method for codon reading. - Proc.

Nat. Acad. Sei. U.S.A.,

1978, v. 75, p. 1759-1762.

Lake J. A. Aminoacyl-tRNA binding at the recognition site is the first step of the

elongation cycle of protein synthesis. - Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A.,

1977, v. 74, p.

1903-1907.

Lucas-Lenard J., Lipmann F. Separation of three microbial amino acid polymerization

factors. - Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 1966, v. 55, p. 1562-1566.

Ninio J. A semi-quantitative treatment of missense

and

nonsense

suppression

in

the

strA and ram ribosomal mutants

of

Escherichia coli. Evaluation

of

some molecular

parameters

of translation in

vivo. - J. Mol. Biol.,

1974, v. 84, p. 297-313.

Wintermeyer W., Robertson J. M. Transient

kinetics of

transfer

ribonucleic

acid

binding

to the ribosomal A and P sites: Observation of a common

intermediate

complex. - Bio-

chemistry, 1982, v. 21, p. 2246-2252.

Глава III

ЭЛОНГАЦИЯ: ТРАНСПЕПТИДАЦИЯ (ОБРАЗОВАНИЕ ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ)

1. ХИМИЯ РЕАКЦИИ

Когда пептидил-тРНК занимает Р-участок, а аминоацил-тРНК окончательно связалась в А-участке, их З'-концы оказываются сближенными в районе пептидилтрансферазного центра на 50S субчастице. Происходит нуклеофильная атака на карбонил сложноэфирной груп-

183

tRNÄcc	tRNA"cc
I	I
О	О
сн2	I
	СН2
тронспептидация | / с \	Д
ОН ОН	о он
	с = о
	R"-CH

N H 2

С = О CH3 -S-(CH2 )2 -CH

NH

Я

но

РИС. 101. Реакция транспептидации, катализируемая рибосомой

L

I

с = о

R'-CH

if» _

с = о

I

R- СН NH .

с=о

I

CH 3 - S - (CH Z ) 2 - CH NH I

пы между пептидным остатком и	тРНК молекулы пептидил-
тРНК аминогруппой аминокислотного	остатка аминоацил-тРНК.

В результате вместо сложноэфирной связи образуется амидная (пептидная) связь между пептидным остатком и аминоацильным остатком молекулы аминоацил-тРНК (рис. 101). Таким образом, субстратами реакции являются пептидил-тРНК и аминоацил-тРНК.

Пептидил-тРНК	называется донорным субстратом, а			аминоацил-
тРНК — акцепторным субстратом.		Продуктами	реакции являются
деацилированная	тРНК и пептидил-тРНК, в		которой	пептидный
остаток оказывается удлиненным		на один аминокислотный остаток
и присоединенным к тРНК в А-участке. Схематически				это показа-
но на рис. 102.

Уже отмечалось, что вместо аминоацил-тРНК в качестве акцепторного (нуклеофильного) субстрата в реакции с пептидил-тРНК могут участвовать 3'-концевые фрагменты аминоацил-тРНК, аминоацильные эфиры аденозина или пуромицин.

Во всех случаях реакция идет, только если ЫНг-группа находится в а-положении аминоацильного остатка. Аминоацильный остаток должен иметь L-конфигурацию. В пептидилтрансферазном центре аминоацильный остаток должен быть присоединен в 3'- положении (но не в 2'-положении) концевого аденозина тРНК или другого акцепторного субстрата. Последнее обстоятельство заслуживает некоторых комментариев. Так, в растворе аминоацильный остаток может мигрировать между 2'- и З'-гидроксилами рибозы концевого аденозина тРНК (см. рис. 27). Связывание аминоацил-тРНК с EF-TU разрешено при обоих положениях амино-

184

ацильного		остатка, и как тройственный комп-
лекс	Aa-(2')tRNA • EF-TU • GTP,				так и
Aa-(3')tRNA • EF-TU			• GTP могут связываться с
рибосомой. По-видимому, после гидролиза
ГТФ	и потери сродства к EF-TU			(стадия кор-
рекции) также разрешена миграция амино-
ацильного		остатка между 2'- и З'-положения-
ми.	Однако аминоацильный остаток				именно
в З'-положении фиксируется пептидилтрансфе-						ТРАНСПЕПТИДАЦИЯ
разным центром (стадия запирания).
Свободный 2'-гидроксил рибозы акцептор-
ного субстрата не существен для реакции
транспептидации; когда он замещен (например,
метилирован) или вообще отсутствует (2'-де-
зоксипроизводное),			акцепторная	активность
субстрата сохраняется. Однако для активности
донорного		субстрата	рибозный	2'-гидроксил
оказывается необходимым.					Р и с		ш С х е м а т р а н с п е п .
Транспептидация			в рибосоме —самый бы-			тидации на рибосоме
стрый шаг элонгационного цикла по сравне-
нию	со связыванием		аминоацил-тРНК и с транслокацией. Во всяком
случае, ни при каких условиях она, по-видимому,							не является	лими-
тирующей стадией цикла.
Механизм катализа реакции транспептидации							рибосомой	служил

предметом многих исследований и дискуссий. Имеется целый ряд указаний на участке имидазольного остатка гистидина какого-то рибосомного белка в катализе. Однако все попытки выделить промежуточное ацилферментное (ацилрибосомное) производное, типа того, что образуется при катализе реакций гидролиза и транспептидации протеиназами, были безуспешны. (Возможно, его и не должно быть в искомом виде, поскольку пептидил-тРНК уже является активированным макромолекулярным ацилпроизводным, которое может рассматриваться как функциональный аналог ацилферментной группы.) Многие считают, что транспептидация в рибосоме катализируется просто вследствие надлежащей пространственной ориентации и сближения реагирующих групп аминоацилтРНК и пептидил-тРНК, без химического каталитического участия каких-

либо специальных	нуклеофильных групп пептидилтрансферазного
центра. В пользу	последнего предположения приводятся данные

о малой специфичности пептидилтрансферазного центра по отношению к типу связи, образование которой может быть им катализировано. Действительно, если к тРНК или аналогу ее З'-конца

присоединен не аминокислотный остаток,	а оксикислотный (НО-
— CHR-CO-— вместо H2N-CHR-CO-), то такое	производное тоже явля-

ется хорошим акцепторным субстратом, и в результате реакции образуется сложноэфирная связь. Подобным же образом, если акцепторным субстратом служит тиоацильное производное, рибосомный пептидилтрансферазный центр катализирует образование тиоэфирной связи. Более того, донорный субстрат также может

185

представлять собой какое-либо производное, и, например, рибосома может катализировать атаку аминогруппы акцепторного субстрата на тиоэфирную группу донорного субстрата с образование тиоамидной связи. Наконец, было показано, что фосфиноэфирный аналог донорного субстрата может реагировать с аминоацил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы, в результате чего образуется неприродная фосфиноамидная связь. Последний факт особенно важен, так как геометрия атакуемой группы и переходного состояния этой реакции (треугольная бипирамида) сильно отлична от таковой в случае нормального донорного субстрата (см. В.III.4); нуклеофильный катализ вряд ли совместим с реализацией реакций обоих типов одним и тем же пептидилтрансферазным центром.

В то же время, однако, рибосомная пептидилтрансфераза в определенных условиях способна использовать воду и низкомолекулярные простые спирты типа метанола и этанола как акцепторные субстраты, производя гидролиз или алкоголиз пептидил-тРНК (см. гл. В.VIII). Последнее трудно объяснить в рамках механизма чисто ориентационного действия рибосомной пептидилтрансферазы.

Наиболее разумной кажется гипотеза о том, что ориентационный эффект пептидилтрансферазного центра действительно принципиально важен в осуществлении реакции транспептидации на рибосоме, но что он может дополняться вкладом специфического микроокружения, способствующего реакции. Не исключено, что вблизи субстратов, ориентированных надлежащим образом в рибо-

соме, локализуются группы, оттягивающие		на	себя протон от
ЫН2-группы акцептора, тем	самым увеличивая	его	нуклеофильность,
и могущие способствовать	протонированию	карбонильного кисло-

рода, увеличивая электрофильность атакуемого углерода сложноэфирной группы донора:

ОR" Н

tRNA"—О—С—СН—N—Н-~»-(х)

tRNA'—О—С—СН—NH

О R'

*

Н

(Y)

Так или иначе, кажется несомненным, что реакция	должна идти
по механизму Sn2 нуклеофильного замещения через	промежуточное
«тетраэдрическое» соединение:

186