25

План реферата

1. Введение

2. Сохранение in vitro генофонда. Коллекции и банки

3. Получение безвирусного посадочного материала

4. Каллусогенез как основа создания клеточных культур

5. Длительно выращиваемые культуры

6. Культивирование отдельных клеток

7. Биотехнологии на основе изолированных протопластов

8. Обзор литературы

Введение

Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы мани­пулировать клетками, нужно выделить их из растения и соз­дать такие условия, при которых они могли бы жить и размно­жаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название куль­туры изолированных тканей и приобрел особое значение в свя­зи с возможностью использования его в биотехнологии.

Биотехнология известна с давних времен, но как самостоя­тельная прикладная наука сформировалась в середине 70-х го­дов нашего столетия, когда человечество осознало необходи­мость первоочередного решения на принципиально новых осно­вах главнейших проблем современности — продовольственной, энергетической, ресурсной, загрязнения окружающей среды и др. Биотехнологические процессы базируются на использова­нии биосинтетического потенциала микроорганизмов, расти­тельных и животных клеток, тканей и органов, культивируемых на искусственных питательных средах. В настоящее время во многих странах мира развитию биотехнологии придается перво­степенное значение в силу ряда существенных преимуществ пе­ред другими видами технологий: биотехнологические процессы обладают низкой энергоемкостью, почти безотходны, экологиче­ски чистые. Вместе с тем, эти технологии предусматривают ис­пользование стандартного оборудования и препаратов, а также проведение исследований круглый год, независимо от климати­ческих условий, занимая при этом незначительные площади. Эти преимущества имеют непосредственное отношение к культуре клеток, тканей и органов растений.

Роль культуры изолированных клеток и тканей в биотехноло­гии следует рассматривать в трех направлениях. Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуциро­вать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и других от­раслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалои­ды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Как правило, вторичные вещества получают из каллусной ткани, выращенной на твердой (агаризованной) или жидкой (суспензион­ная культура) питательной среде. На основе клеточных техноло­гий получают такие медицинские препараты, как диосгенин из клеток диоскореи, аймолин из клеток раувольфии змеиной, тони­зирующие вещества из клеток женьшеня, используемые в меди­цине и парфюмерии. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Преимуществом такого способа получения веществ вторичного синтеза является также возмож­ность использовать для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию круглый год.

Второе направление — это использование культуры изоли­рованных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала от вирусов и других патогенов. Этот метод, назван­ный клональным микроразмножением растений, позволяет по­лучать от одной меристемы сотни тысяч растений в год.

Третье направление — использование изолированных клеток в селекции растений, дающее возможность получать быстрорасту­щие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факто­рам среды: засухе, засолению, низким и высоким температурам, фитопатогенам, тяжелым металлам и др. Вместе с тем, это на­правление предусматривает создание новых растений путем слияния изолированных протопластов и получения неполовых (со­матических) гибридов. Перенос в изолированные протопласты чу­жеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свой­ствами. Культивирование изолированных пыльников и семяпочек на искусственных питательных средах дает возможность получать гаплоиды, культивирование зародышей — прием, позволяющий получать растения из невсхожих (с плохо развитым эндоспермом) гибридных семян. А оплодотворение в пробирке позволяет пре­одолеть нескрещиваемость некоторых растений.

Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток, их дифференцировку и регенерацию из них взрослых растений. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизма морфогенеза in vitro, регенерации и лежащих в их основе процессов.

Метод культуры тканей, клеток и изолированных протопластов возник более 50 лет назад. Первые успехи были достигнуты в 1907-1913 гг. Харрисоном и Каррелом по культивированию животных тканей, благодаря выращиванию их на питательных средах природного происхождения, таких как плазма крови и зародышевая жидкость. Попытки по аналогии вырастить изолированные ткани растения на растительных экстрактах были неудачны. Одной из причин всех предшествующих неудач являлось использование в экспериментах мало подходящих для проявления ростовой активности тканей и клеток высших растений. В 1922 г. американский исследователь Роббинс и независимо от него немецкий ученый Котте показали возможность культивирования на синтетической питательной среде меристемы кончиков корня томатов и кукурузы

В настоящее время известно более 150 видов растений, ткани которых удалось выращивать in vitro.

Разработаны составы ряда питательных сред, что позволило получать длительные пересадочные культуры из разных органов и тканей растений.

Среда Мурасиге и Скуга (MS) - наиболее универсальная и многоцелевая среда, пригодная для растительных клеток многих видов. Дает хорошие результаты при каллусообразовании большинства растений, хорошо поддерживает неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у большинства двудольных видов.

Среда Гамборга и Эвелега (среда Б5) дает хорошие результаты при культивировании клеток и тканей бобовых растений.

Среда Уайта применяется для укоренения побегов и нормального роста стеблевой части после регенерации.

Среда Нич, Китайские среды рекомендуются для индукции андрогенеза в культуре пыльников и для индукции морфогенеза у злаков.

Среда Као и Михайлюка используется для культивирования единичных (или с малой плотностью высева) изолированных протопластов и клеток.

Изучено значение макро- и микроэлементов для поддержания ростовой активности каллусной ткани. Выявлена потребность тканевых культур в витаминах и стимуляторах роста.

Опытами Скуга и Миллера (1955) по изучению способности к делению и образованию каллуса клетками сердцевинной паренхимы стебля табака был открыт новый класс стимуляторов роста растений - цитокинины. Полученный в результате щелочного гидролиза ДНК животного происхождения кинетин (6-фурфуриламинопурин) оказался способным к комбинации с β-индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы, лишенной проводящих пучков и камбия. Клетки ткани сердцевинной паренхимы, помещенной на питательную среду с ИУК, но без добавления этого нового стимулятора, не делились.

В 1960 г. Кокингом был открыт метод получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектоли-тических и целлюлитических ферментов, выделенных из культуральной жидкости грибов. В 1971 г. были найдены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало клеточным линиям, способным в ряде случаев к морфогенезу. Изо­лированные протопласты, еще, не образовавшие клеточную стенку, были исполь­зованы для разработки методов гибридизации соматических клеток путем слия­ния протопластов с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) и введения в них вирус­ных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. Разработка методов электро­слияния изолированных протопластов Зиммерманом в 1984 г. и разнообразных методов селекции гибридных клеток значительно облегчила гибридизацию со­матических клеток растений.