- •Индикация вируса в патологическом материале.
- •Изоляция (выделение) вируса из патологического материала.
- •Доказательство этиологической роли.
- •Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день.
- •Заражение в аллантоисную полость.
- •Заражение через искусственную воздушную камеру на хао.
- •Рнга – реакция непрямой гемаглютинации.
- •Ртга – реакция торможения гамаглютинации
- •РтгАд – реакция торможения гемадсорбции
- •Естественная видовая резистентность.
- •Семейство Flaviviridae (flavus – желтый).
Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день.
Топография куриного эмбриона (продольный разрез, 12 дней)
-
Скорлупа
-
Подскорлупная оболочка
-
Воздушная камера
-
Аллантоисная полость
-
Желточный мешок
-
Альбуминный мешок
-
ХАО – хорион-аллантоисная оболочка
-
Амниотическая полость
-
Эмбрион
-
Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной)
Для заражения выбирают здоровые эмбрионы. Для этого проводят овоскопию. На скорлупе делают пометки карандашом – границы воздушной камеры и местоположение зародыша.
-
Заражение в аллантоисную полость.
Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут:
-
название вируса
-
дату
-
фамилию
-
Заражение через искусственную воздушную камеру на хао.
-
Делается отверстие в области воздушной камеры.
-
Делается окошко «А»
-
Отсасывается воздух из воздушной камеры.
-
В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем.
-
На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия.
Индикация вируса в курином эмбрионе.
-
Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные.
-
Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений.
-
Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины).
-
Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза.
-
Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация.
-
Органы зародыша – некроз, кровоизлияния.
-
Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур)
Использование культуры клеток.
Культура клеток это клетки многоклеточного организма живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro).
Типы культур клеток.
-
Тип клеток
Свойства
Частично
Трипсинизированные
Перевиваемые
Диплоидные
Происхождение
Из органов
Из первичных
Из первичных
Продолжительность жизни
3-5 пассажей
Неограниченное
количество
пассажей
Около 50 пассажей:
-
гибель
-
перевивание
Кариотип
2n
Xn
2n
Способность
образовывать
опухоли
-
+
-
-
Этапы получения первичной культуры.
-
Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).
-
Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.
-
Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина.
-
Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.
-
Проводят дробную трипсинизацию.
-
Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.
-
Центрифугация в течении 10 минут – 1000 об/мин, затем трипсин сливают.
-
Клетки помещают в питательную среду:
-
среда 199
-
среда Игла
-
среда гидролизатлактальбумина.
-
Проводят подсчет клеток в камере Горяева
-
Клетки разводят питательной средой до посевной концентрации от 500 000 до 1 000 000 клеток на мл.
-
Добавляют 10% сыворотки КРС.
-
Разливают в пробирки, матрасы или роллерные колбы и культивируют.
-
После формирования монослоя (3-5 день) молодую культуру клеток заражают вирусом.
Лучше всего работать с диплоидными культурами клеток, так как как они свободны от контаменантов (бактерии, грибы, микоплазмы)
Используемые растворы.
-
раствор Хенкса (дистилированная вода, соли, антибиотики)
-
раствор Эрла (имеет несколько другой солевой состав) Эти растворы используют как солевую базу для отмывания клеток.
-
Раствор трипсина (0,25%) используют для разделения клеток, для снятия их со стекла.
-
Раствор Версена используют для снятия клеток со стекла при пересеве.
Используемые среды.
-
Среда 199 – 20 АМК, более 17 гормонов, всего 69 компонентов.
-
Среда Игла (Eagle)
-
Среда ГЛА (гидролизатлактоальбумина.
Заражение культуры клеток.
-
С выросшего монослоя сливают ростовую питательную среду.
-
Отмывают клетки от ростовой питательной среды р-ром Хенкса или Эрла.
-
Заливают вирус содержащий материал 0,1-0,2 мл.
-
Помещают в термостат (30-60 минут)
-
Вирус содержащий материал удаляют (не обязательно) и заливают поддерживающую среду.
-
Зараженную культуру ставят в термостат (37 С) и ежедневно контролируют просматривая под микроскопом.
Методу обнаружения вируса в культуре клеток.
ЦПД – цитопатическое действие.
-
Гибель клетки с округлением. Округленная клетка слабо прикрепляется к субстрату и выпадает из монослоя, который приобретает вид кружева.
-
Гибель клетки с фрагментацией.
-
Образование симпластов.
Адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток.
При проникновении вируса через клеточную оболочку в ней задерживаются вирусные белки и оболочка приобретает свойства белков вируса, а следовательно способность к ГАд.
Серологические реакции.
-
РИФ – реакция иммунофлюорисценции.
АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом.
-
ИФА – иммуно-ферментный анализ.
АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию.
-
РСК – реакция связывания комплемента.
АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная.
-
РДП - реакция диффузной преципитиции.
АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации.