Konspekty_Enzimologiya

Введение в энзимологию

Преподаватель - Виктор Васильевич Асеев.

Для облегчения понимания - цвет комментариев: Полина Деревянко, Карпова Алла, Козлова Анастасия, Колесник Матвей, Кочерыжкина Елена, Никитин Даниил, Огиенко Анастасия, Рассказова Анастасия, Пирогов Сергей, Юдин Денис.

Содержание:

Лекция 1.

8.9.2015. Что такое фермент. Свойства и составные части ферментов. Лекция 2.

15.9.15 Погрешности измерения. Условия, влияющие на активность фермента. Лекция 3.

22.9.15 Измерение активности ферментов Лекция 4.

29.9.15 Использование ферментов. Критерии реагента. Проблемы выделения ферментов.

Лекция 5.

6.10.15 Методы разрушения клеток, действия после разрушения, очистка и концентрирование фермента Лекция 6.

13.10.15 Методы осаждения белков: растворителями, высаливанием, термоинактивацией. Катионнообменники и анионообменники. Лекция 7.

20.10.15 Гель-фильтрация (проникающая хроматография). Лекция 8.

27.10.15 Метод хроматофокусирования. Метод гидрофобной хроматографии белков. Метод аффинной хроматографии. Метод имидазольного радикала. Денатурирующий электрофорез.

Лекция 9.

3.11.15 Электрофорез. Экстракция белков из геля. Диск-электрофорез. Лекция 10.

10.11.15 Разделение в градиенте рН, 2 применения электрофореза: препаративный и аналитический, изотахофорез, двумерное разделение, выделение белка из сложной смеси. Характеристики очистки белка.

Лекция 11.

17.11.15 Систематика ферментов. Лекция 12.

24.11.15 Термодинамика образования фермент-субстратного комплекса. Лекция 13.

1.12.15 Необратимое ингибирование, методы выражения концентрации фермент+субстрат, ингибирование ферментов.

Лекция 14.

8.12.15 Конкурентное и бесконкурентное ингибирование. Лекция 15.

15.12.15 Регуляция работы ферментов, локализация ферментов.

Литература по курсу:

Диксон, Уэбб. Ферменты Кузьменко, Байрамов. Кинетика

Петушкова. Кинетика ферментативных реакций Скоупс. Методы выделения и очистки белков

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

8.9.2015. Что такое фермент. Свойства и составные части ферментов.

Ферменты - макромолекулярные катализаторы биологического происхождения. Как правило, являются белками. Но не все.

Катализ как процесс открыли в области химии. Начало 19 века - появилась серия работ (в Париже и Спб).

Энзимология началась в начале 19 века, когда Кирхгоф и ещё один человек независимо друг от друга выяснили, что если измельчить зёрна пшеницы и смешать с водой, то этот раствор превращает крахмал в сахар (солод). Они впервые открыли ферментативный процесс (1813-1814 гг).

Удрожжей, использующихся в производстве пива, нет амилазы.

Ушумеров описан процесс створаживания молока с помощью сычужного фермента телёнка. (~6000 лет)

В конце 18 - начале 19 века постулировано, что пищеварение - не механическая обработка пищи, а её химическое расщепление.

19 век: открыто расщепление сахарозы дрожжами

Чтобы усвоить сахарозу, дрожжи должны сначала расщепить ее на моносахариды. Для этого у них есть специальный фермент — инвертаза. Фермент локализован на клеточной мембране, и свою работу (то есть расщепление сахарозы) он выполняет не внутри клетки, а снаружи. Именно это обстоятельство и создает предпосылки для возникновения у дрожжей «моральной дилеммы». Поскольку производство моносахаридов происходит во внешней среде, образовавшиеся глюкоза и фруктоза становятся потенциально доступны не только той клетке, которая их произвела, но и всем окружающим. Значит, можно воровать «чужие» моносахариды, не тратя собственные ресурсы на дорогостоящее производство фермента инвертазы. Клетки, производящие фермент, оказываются «альтруистами»: они тратят свои силы на то, чтобы облегчить жизнь окружающим.

Для начала авторы проверили, действительно ли дрожжи способны «помогать» друг другу, то есть делиться пищей. Если это так, то в среде, содержащей сахарозу (но не глюкозу), дрожжи должны размножаться тем быстрее, чем выше плотность популяции. Это предположение подтвердилось. Значит, кооперация у дрожжей действительно существует: глюкоза, производимая клеткой, не остается полностью в ее распоряжении, а растворяется в среде, становясь доступной другим клеткам. Чем выше плотность популяции, тем выше концентрация глюкозы в среде и тем быстрее растет вся популяция в целом. Теперь нужно было выяснить, успевают ли «честные» дрожжи, расщепляющие сахарозу, ухватить себе хоть какую-то часть произведенных ими моносахаридов до того, как те растворятся в окружающей среде и станут общим достоянием. Эксперименты дали положительный ответ на этот вопрос. Однако доля пищи, достающаяся «честным» дрожжам за их труды, оказалась очень небольшой: лишь 1% произведенной глюкозы достается производителю, а 99% поступает в общее пользование.

Обычно свободноживущие одноклеточные имеют 2000-2500 ферментов. А минимально для свободной жизни надо 1000. Большинство - внутриклеточные ф-нты.

Доказательства утверждения “Ферменты - ВМС”:

-не удаляются из раствора при диализе

-осаждаются с веществами, осаждающими ВМС

Выяснили, что катализаторы переставали работать при нагревании, Возник спор Пастера и Либиха: Пастер утверждал, что катализ - свойство живого, Либих - что катализом занимаются конкретные вещества, которые могут быть выделены.

“Фермент” происходит от латинского fermentio - “брожение” “Энзим” - от греческого enzamon - “в дрожжах”

“Диастаза” - раньше так по-французски называли все ферменты, теперь - только некоторые виды растительных амилаз

Бюхнер с помощью воронки Бюхнера (воронку сделал другой Бюхнер, это важно) получил бесклеточный экстракт дрожжей и показал, что клетки для катализа не нужны.

Почти все реакции в живых клетках катализируются ферментами. Катализаторы в клетке определяют, какие процессы будут там происходить.

Реакции, идущие без ферментов, - изомеризации, образование основания Шиффа при циклизации пролина, переход енол пирувата в пируват, образование пиридинового кольца в синтезе никотинамида из триптофана.

Катализатор-не-фермент: с повышением концентрации субстрата линейное увеличение скорости реакции Фермент: с повышением концентрации субстрата скорость реакции выходит на плато.

Ферменты не меняют термодинамику реакции.

В 1926 Дж. Самнер открыл, что белковые кристаллы из конских бобов расщепляют мочевину (=> там есть уреаза). Нобелевская премия за доказательство белковой природы ферментов. Хотя вообще-то в этих кристаллах было 30% уреазы, остальное - небелковые примеси.

1930-е: В Кембридже - серия опытов по очистке протеолитических ферментов животных. Показали, что по мере протеолиза ферментативная активность падает. Одновременно с этим велись работы по очистке белков.

1960-е - процесс получения чистых ферментов стал массовым.

С помощью генной инженерии можно менять специфичность ферментов, получать нужные ферменты в больших количествах, изучать участие отдельных групп в ферментативной активности. Можем делать изменения в тех местах, где закодирован этот фермент.

Например, ф-нт, метилирующий цитозин по 5-ому положению. Поменяем одну аминокислоту на серин - будет метилировать по 4-ому.

Еще при замене одной аминокислоты лактатдегидрогеназа превращается в малатдегидрогеназу

Можно синтезировать искусственно те ферменты, которые в больших количествах не встречаются.

Например, гормон роста (ГР или СТГ): 190 аминок-т. До появления генно-инженерных методик ГР получали из свиней, так как свиней много и у них гормон отличается от человеческого только в одном положении.

Особенности ферментов, отличающие их от небиологических катализаторов:

-нелинейный рост скорости реакции (есть выход на плато)

-эффективность катализа: увеличение скорости реакции в 10^4 - 10^17 (последнее - декарбоксилирование оротовой кислоты) раз по сравнению с максимумом ускорения в 1000 раз для небиологических катализаторов. Померить сложно, поэтому, активность фермента выражается в количестве превращаемого вещества, а скорость неферментативной реакции полагается равной 0. В результате образуются вещества, которые без ферментативного катализа не стали бы образовываться или делали это очень медленно.Повторное возникновение жизни из небиологических веществ невозможно: все промежуточные вещества будут тут же съедены живыми.Такая ферментативная эффективность даёт живым преимущество: можно быстро сделать какое надо вещество, а не накапливать его загодя.

-регулируемость: вещества образуются только когда нужно и только сколько нужно.

-высокая специфичность => в клетке не образуется ненужных компонентов. Бывают ферменты с групповой специфичностью (например, алкогольдегидрогеназа окисляет спирты или восстанавливает альдегиды до спиртов, протеазы расщепляют связи после аминокислот определённого типа)

-сопрягают химические реакции - реакции идут в мягких условиях, могут сдвигать равновесие невыгодной термодинамически реакции в нужную сторону, используя энергию сопряженных реакций, производя активацию молекул фермента (например, у Azotobacter 100% эффективность)

Активный центр - область фермента, непосредственно взаимодействующая с превращаемым веществом.

-связывающий центр

-каталитический центр

Четкой границы нет, это разные участки одной полипептидной цепочки, собранной в трехмерном пространстве. Эта область меняется в ходе протекания реакции. Участки, не входящие в активный центр,тоже могут влиять на его функциональность.

Аллостерическая регуляция - когда с ферментом далеко от его активного центра связывается молекула и это влияет на катализ.

Есть гипотеза, что в катализе участвует вся белковая молекула.

Молекула фермента устроена так, что множество тепловых флуктуаций в разных участках молекулы суммируются в активном центре, и движение последнего катализирует реакцию.

Есть ферменты, примерно одинаково хорошо катализирующие прямую и обратную реакции, поэтому понятия продукта и субстрата условны. Если дельта G реакции не сильно далеко от 0 => реакция обратима.

В реакции связывания также часто участвуют:

Коферменты - дополнительные небелковые молекулы, специфически соединяющиеся с соответствующими белками, называемыми апоферментами, и играющие роль

активного центра или простетической группы молекулы фермента. Комплекс кофермента и апофермента образует активную молекулу фермента, называемую

холоферментом. (источник - Википедия)

●простетические группы - молекулы, прочно (почти всегда - ковалентно) и постоянно связанные с ферментом. Простетические группы могут быть органическими (витамины, углеводы, липиды) или неорганическими (например, ионы металлов)

●диссоциируемые кофакторы - могут отделяться от молекулы фермента:

○могут отделяться, но в норме не должны

○должны отделиться (в ходе ферментативной реакции претерпевают необратимые изменения и регенерируют, только отделившись), в том числе косубстраты. Яркий примерНАД(Ф)Н. Если он не уйдет после реакцииследующий каталитический раунд не запустится.

Активатор - любое вещество, увеличивающее активность фермента. Может быть любой компонент цитоплазмы клетки, без него фермент не существует. Ингибитор - вещество, понижающее активность фермента.

15.9.15 Погрешности измерения. Условия, влияющие на активность фермента.

Скорость ферментативной реакции меряется в количестве превращённого вещества на единицу времени, т.к. непосредственно скорости ферментативной и неферментативной реакций сравнить нельзя из-за их огромной разницы. Измеряем либо приращение продукта, либо убыль субстрата.

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность. Активность – более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции, а именно убыль субстрата или накопление продукта.

Таким образом, при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три меняющихся фактора:

●масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата,

●время, потраченное ферментом на реакцию,

●количество биологического материала, содержащего фермент (так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально).

Основы количественного определения активности ферментов

Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент .

Впрактике обычно используют:

●единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),

●единицы времени – минута, час, секунда,

●единицы массы или объема – грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные – катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с*л, г/час*л, МЕ/л, кат/мл и т.д.

Причины плато:

- с течением времени может снижаться активность

фермента - субстрат кончается

(наступает равновесие)

Скорость превращения измеряют либо по убыли субстрата, либо по прибыли продукта.

Активность фермента меряется на линейном участке кривой активности (при времени, близком к 0) - там будут истинные значения скорости.

При измерении активности часто можно получить неканоничные графики.

Причины формы кривой (1), когда нет линейного участка:

● недостаточно субстрата ● нереакционноспособность фермента

в этих условиях:

-

слишком холодно

-

неоптимальный рН

- (ин)активация вещ-ва

●слишком сильное разведение фермента, он денатурирует (можно добавить балластные белки (альбумин, лактальбумин и т.п.) или вещества, связывающие свободную воду (глицерин и т.п.)). В растворе глицерина (30%) при заморозке происходит стеклование (витрификация) вместо кристаллизации.

●фермент нестабилен

Причины формы кривой (2), когда линейный участок-то есть, но померить не можем:

●слишком малое разведение фермента (высокая активность фермента => необходимо понизить концентрацию [E] )

Тут (куда указывает стрелочка на рисунке) линейный участок, но вообще кривая ненормальная. В начале могло быть:

● активность фермента могла быть подавлена, например произошла

агрегация фермента ● в ферменте нет нужного кофактора

(например, иона металла типа Zn2+ в алкогольДГ, для амилазы - Са2+), а когда мы прилили раствор субстрата и кофактора, фермент это кофактор связал.

Чтобы от этого избавиться:

- фермент разводят до добавления в реакционную смесь и инкубируют в той температуре, в которой

изменяется активность - чтобы он диссоциировал заранее

-проводят преинкубацию с нужными ионами или кофакторами

Внекоторых реакциях невозможно привести график к нормальному, тогда считают как есть, с ошибкой.

При измерении активности фермента с одной стороны стоят точность, а с другой - время и сложность доставания реактивов.

Минимально нужно замерить 4-5 точек на графике (из которых 2-3 гарантированно должны принадлежать линейному участку).

Для нормальной работы фермента нужны:

1)оптимальный рН - буферный раствор. Надо стараться, чтобы буфер не влиял на саму реакцию; быть осторожней с разведением буфера. От рН зависят и активность, и стабильность фермента. Для большей части ферментов верна

такая зависимость (колокол рН):

На рисунке у стрелочки надпись: “оптимальное соотношение протонированных и депротонированных групп в ферменте”.

Перегибы указывают на рН, соответствующие константам диссоциации аминокислот в активном центре.

рН-оптимум фермента м.б. не точкой, а плато, и находиться где угодно, но чаще всего - в слабокислой области рН (6-7). У пепсина левее оптимума (около 2 рН) идет сразу денатурация (см. график ниже).

Но! рН может меняться при взаимодействии компонентов (сдвиг происходит): поглощение/выделение протона в процессе реакции (такое происходит при гидролизе АТФ), в т.ч. образование плато => нужен буфер для поддержания постоянного рН. Условие буферного раствора - должен не взаимодействовать с ферментом, субстратом, кофакторами.

-Фосфатный буфер связывает ионы, кроме того может регулировать работу фермента. Некоторые ферменты используют фосфат в качестве субстрата. Вообще фосфатанион, от которого так или иначе зависят очень многие ферменты.

-Ацетатный буфер также может влиять на активность фермента как регулятор.

-Цитратный буфер связывает важные для катализа ионы (сильный комплексообразователь).

-Аммониевый буфер обладает малой ёмкостью.

-Трис зависит от разведения. Оптимум рН слабощелочной (6-8).

Совокупность всех буферов позволяет перекрыть весь диапазон требуемых рН. Но не все просты в употреблении, чаще используем концентрат буфера, который потом разводим, а рН меняется, как у Триса, например, на 0,5-1.

N.B.: 20 буферов Гуда перекрывают от 6,15 до 8,55.

Буферы лучше хранить концентрированными и при невысоких температурах, некоторые лучше в темноте.

2) оптимальная температура

У стрелочки на рисунке надпись “из-за денатурации белка”.

Бывают ферменты, оптимум которых 15-20 градусов и даже 12 (чаще около 40-60 градусов в среднем).

Чтобы охарактеризовать фермент, его активность меряют не при его температурном оптимуме,т.к. в этой области маленькое to вызовет большую ошибку в Е, а при низких to (принято при 30оС, исключения - ферменты термофильных организмов и нетермостабильные ферменты). Исходно мерили при 25 градусах, но из-за Индии, Бразилии и т.д. проще стало всем мерить при 30 градусах.

N.B.: Термофильные ферменты используют в ПЦР и добавляют в стиральный порошок - там они гидролизуют жиры. Иногда приходится мерить при пониженных температурах из-за неустойчивых промежуточных комплексов (20-25 градусов). Чтобы не было скачка температур, лучше добавлять минимальный объём концентрированного раствора фермента.

3)кофакторы (например, ионы Mе2+ и Mе3+) - входят в состав АЦ или обеспечивают правильную конформацию белка. Легко диссоциируют в ряде случаев

●Mg2+: входит в активный центр DNA-pol и необходим для всех ферментов, использующих субстраты в виде магниевых солей (например, нуклеотиды).

●Zn2+: в алкогольдегидрогеназе, карбоангидразе. Координирует воду в активном центре так, что она легко атакует субстрат. Работает как кислота Льюиса, стабилизируя неподеленные электронные пары нуклеофилов.

●Fe2+, Cu2+ - переносят электроны в клетке, так как способны менять

степень окисления.

●Mn2+- тоже участвует в ОВР, часто может заменять магний, если марганец в форме Mn2+

●Ca2+ - важен для немногих ферментов, так как его концентрация в цитоплазме очень мала, он же сигнальный..

●Mo, V в нитрогеназе, нитратредуктазе и у метаногенов. А еще молибдоптерины, которые кофакторы в разных интересных процессах.

4)наличие или отсутствие S-S мостиков (чаще всего они мешают реакции и их надо восстанавливать). Раньше для восстановления S-S мостиков пользовались свободным цистеином (получали из волос цистин >10%), но его надо много по массе. Поэтому стали использовать синтетический аналог цистеина - 2-меркаптоэтанол. “Воняет ужасно”, 5-10мМ, летучий, оказывает нервно-паралитическое действие.

Потом для этой цели стали использовать димер меркаптоэтанола - дитиотреитол (DTT): менее пахуч и летуч, более устойчив в растворах и энтропийный фактор

благоприятствует его восстановительной способности. Когда DTT присоединяется к одному из атомов S в белке, оставшиеся стадии протекают с легкостью, потому что реакция высвобождения окисленного DTTмономолекулярная, то есть для ее протекания одной молекуле не надо искать другую в растворе, а достаточно лишь замкнуться в цикл. Кроме того, в начале реакции у нас было две молекулы, а в концетри. Энтропия возросла. Норм?(можно объяснить, как именно, я не знаю) - мономолекулярная реакция всегда более вероятная типа было две молекулы, стало три, так? ну белок - это одна молекула, имхо суть в том, что больше вероятность того, что конец одной молекулы DТТ окажется близко к S-S мостику, на предпоследней стадииок, а теперь давайте это напишем!). Кроме того, в конце реакции образуется стабильный шестиатомный цикл.

Штука в конце - циклический или окисленный дитиотреитол. ДОЛЖНО БЫТЬ 4 атома углерода после присоединения ДТТ к мостику.

22.9.15 Измерение активности ферментов

Для измерения активности нужно:

●иметь линейный участок на кривой активности

●проводить реакцию при оптимальном рН

●30оС

Производные активности:

●удельная - отнесённая к мг белка. Увеличение удельной активности - основной критерий очистки фермента (обратная активность фермента в данном препарате)

●в пересчёте на активный центр фермента - отнесённая к числу оборотов фермента (числу молекул субстрата, превращаемых за одну минуту, на одну молекулу фермента; безразмерная величина - то, сколько раз 1 АЦ осуществляет реакцию в единицу времени)

Техника измерения активности фермента: