Molbiol_Arina
.docРНК-полимераза II производит предшественников для матричной РНК, а также для большинства малых ядерных РНК и микро РНК. Нужны промоторы. Вообще говоря, промоторы обыкновенно расположены перед геном (удивительный факт, не правда ли!), если в нескольких тысячах п.о. от inr, то это энхансеры. Эукариотический РНК-пол-II-зависимый промотор: консенсусная последовательность ТАТААА, распознаваемая ТВР и В-элемент, распознаваемый фактором TFIIB (7 нуклеотидов рядом с ТАТА). Оба эти участка обычно находятся недалеко от inr (в 30-40 п.н.)
РНК-полимераза данного типа локализована в нуклеоплазме, ее субстратом могут быть как кодирующие, так и регуляторные РНК, чувствительна к α-аманитину. Наиболее хорошо изучена РНК полимераза дрожжей. Клонированы гены, кодирующие 12 субъединиц этой РНК полимеразы. Получены кристаллы (без слабо удерживаемых в составе комплекса субъединиц Rpb4 и Rpb7, отсутствие – леталька, но у 4 – только условная; обе они нужны для удерживания зажима в положении «закрыто» с фиксацией ДНК в нем), проведен рентгеноструктурный анализ. Корнберг, между прочим, был таким молодцом, что выделил сразу 12-субъединичный комплекс аффинкой ха таггированную Rpb4. Эукариотическая РНК полимераза сама по себе не узнает ДНК. Для ее посадки на промотор требуются общие факторы транскрипции. На последовательности ДНК имеем сайты связывания оных факторов: UAS (upstream activating sequences: CAT-box и GC-box), BRE для TFIIB, ТАТА-последовательность (не всегда), участок начала транскрипции inr с пиримидиновой последовательностью, а уже потом собственно ген.
По функциональному признаку принято различать три класса факторов транскрипции. К первому классу относятся основные факторы транскрипции, обеспечивающие нерегулируемый базальный уровень транскрипции и функционирующие в клетках всех типов. Ко второму классу относятся факторы транскрипции, специфически взаимодействующие с определенными последовательностями ДНК, которые являются основными регуляторами транскрипции и обеспечивают тканеспецифическую экспрессию генов. Третий класс факторов транскрипции (в том числе многочисленные TAF-белки (TAB-associated factors)) представлен белками - коактиваторами транскрипции, которые действуют согласованно с основными и тканеспецифическими факторами, обеспечивая более тонкую регуляцию транскрипции.
TBP-ассоциированные факторы (TAF) отличаются от основных факторов и активаторов транскрипции. После клонирования генов TAF-факторов и очистки кодируемых этими генами белков выяснилось, что TAF-белки обеспечивают физическое взаимодействие между активаторами транскрипции и основными факторами, поскольку они обладают способностью связывать белки обеих групп. Те же функции присущи SRB-белкам дрожжей. Таким образом, коактиваторы транскрипции являются белками-адаптерами, обеспечивающими перенос регуляторного сигнала от тканеспецифических белков-активаторов транскрипции к РНК-полимеразе II. TBP: нужен для всех трех полимераз, высоко консервативен у эукариот, связывается с малой бороздкой, вызывает изгиб ДНК (45о), необходим для транскрипции даже с тех промоторов, которые не содержат ТАТА бокса. ТВР является частью общего транскрипционного фактора TFIID = TBP + TAFIIS . Для инициации транскрипции РНК полимеразой II необходимы шесть так называемых «общих» факторов транскрипции.
Общий транскрипционный фактор прилетает сюда, садится на ТАТА с помощью ТВР (а может и без ТАТА), дальше TAFs мистическими «различными транскрипционными факторами» притягивает к себе UAS. TFIIA и TFIIB, сидя по другую сторону ДНК от этой глыбы, стабилизируют взаимодействие TBP с ДНК, контактируя одновременно с ДНК и TBP. Появляется TFIIF, садящийся на TFIIB, и обеспечивает посадку собственно полимеразы на комплекс (полимераза приземляется на inr, но на картинке в презентации бочком прижимается к TFIID). Последними, все в белом, приходят TFIIE и TFIIH, садясь на ДНК по другую сторону от полимеразы, Н – на нити, Е – на Н. Из них Н включает киназу и АТФ-зависимую ДНК-хеликазу, локально плавящую ДНК в точке начала транскрипции. Функция Е не очень ясна.
Все эти мелкие подробности узнавали методами band-shifting (ДНК при связи с белком идет в геле сильно медленнее свободной) и footprinting для уточнения локализации белка на ДНК (если белок сидит, то ДНКазы не смогут внести разрыв и на форезе не будет определенной полосы). Хитрецы, короче.
Перед началом элонгации выделяют особую стадию «освобождения промотора» При этом часть общих транскрипционных факторов остается на промоторе, тогда как другие (TFIIF) перемещаются вместе с элонгирующим полимеразным комплексом. В момент освобождения промотора элонгирующий комплекс остается крайне нестабильным и может легко «соскочить с ДНК». Комплекс заметно стабилизируется после включения 8-9 нуклеотидных остатков (именно такова длина ДНК-РНК гибрида в составе транскрипционного комплекса). Важную роль в переходе от «инициаторного» к элонгирующему комплексу играет фософорилирование сериновых остатков 2 и 5 в повторяющихся много раз гегтапептидах YSPTSPS С’-концевого домена каталитической субъединицы РНК-полимеразы II. Первичное фосфорилирование серинов 5 осуществляет киназная субъединица (Kin28) транскрипционного фактора TFIIH. Предынициаторный комплекс может собраться и без АТФ, Е и Н, но «поехать» не может, т.к. хеликаза без АТФ не расширяет петлю. Т.е. критическим является увеличение локально денатурированного участка фактором IIH. Для этого и требуется АТФ (гидролиз β-γ связи, а не α-β связи, которая гидролизуется при включении рибонуклеотидов в РНК). Для фосфорилирования CTD домена РНК полимеразы роль донора энергии может выполнять и ГТФ. При высоком уровне транскрипции некогда ждать, пока вся махина соберется сама, поэтому в клетке есть т.н. медиатор (комплекс полимеразы и некоторых транскрипционных факторов, кроме ТВР), посадка которого на ТВР должна все ускорять.
Теперь поговорим о регуляторных элементах поподробнее. Энхансеры и сайленсеры, несмотря на удаленность от гена, модулируют скорость его транскрипции. Энхансеры, вообще говоря, могут быть где угодно: до гена, после, внутри и рядом, - им наплевать. Не вполне ясно, что именно регулируют энхансеры: скорость работы промотора (число инициаций в единицу времени) или его статус (активный/неактивный), а также как они это делают. Есть преобладающая гипотеза, что некий (инициаторный?) комплекс собирается на энхансере и шурует помогать полимеразе, которая с малоэффективным эукариотическим промотором уже совсем из сил выбилась. Либо участок с энхансером приближается к целевому путем образования петли ДНК и, опять-таки, неся на себе нечто важное, помогает. Сайленсеры + корепрессоры, как видно по названию, замедляют транскрипцию. Интересно, что одна и та же последовательность, в зависимости от факторов транскрипции, на нее садящихся, может быть как энхансером, так и сайленсером.
Все известные в настоящее время энхансеры представляют собой площадки для связывания транскрипционных факторов. Энхансеры, как и их транскрипционные факторы, могут быть как универсальными (вирусов SV-40, Polyoma, CMV – к фактору Sp1), так и тканеспецифичными (глобиновых генов, к эритроид-специфичному фактору GATA-1). Важный лекционный пример: Внутриклеточные рецепторы гормонов – одна из групп транскрипционных факторов. Рецепторы стероидных гормонов (глюкокортикоидный рецептор) находятся в цитоплазме, в комплексе с подавляющим их активность белком. При связывании лиганда (гормона) рецептор освобождается из комплекса, мигрирует в ядро и связывается с энхансерами определенной группы генов, стимулируя их работу. Рецептор тироидного гормона (TR) находится в ядре в комплексе с рецептором ретиноевой китслоты (RXR). Этот рецептор связывается с определенным классом мишеней (участков узнавания (HRE)), где в отсутствии связанного тироидного гормона привлекает корепрессоры транскрипции, а в присутствии – коактиваторы.
Для РНК полимеразы II и ее аналогов у других организмов характерна тенденция к временной (пауза – если 3'-конец остался в активном центре) или бессрочной (арест – 3'-конец удаляется из АЦ транскрипционным фактором TFIIS) остановке элонгации. Для обеспечения эффективной элонгации необходим целый ряд вспомогательных факторов, один из которых (TFIIF) является общим фактором транскрипции. Существует и негативный фактор элонгации NELF, который стимулирует остановку Pol-II. NELF связывается с комплексом Pol-II-DSIF и стимулирует РНКазную активность полимеразы II.