Рекомбинация: три источника изменчивости геномов

Рекомбинационный процесс , в той или иной степени, в той или иной форме, представлен в жизненном цикле всех существующих на Земле видов. У большинства многоклеточных в жизненном цикле можно выделить три основных источника генетических рекомбинаций: 1) Кроссинговер - процесс реципрокных обменов генетической информацией в пределах хромосомы . 2) Независимая сегрегация негомологичных хромосом в мейозе - процесс, обеспечивающий перекомбинирование целых хромосом. 3) Кроссбридинг - процесс перекомбинирования имеющихся в популяции гаплоидных геномов .

Различия между тремя источниками комбинативной изменчивости непринципиальны, они связаны лишь с конкретными механизмами перекомбинирования генов и размерами перекомбинируемых фрагментов генома. Хорошей иллюстрацией феноменологического сходства между случайной сегрегацией негомологичных хромосом и кроссинговером могут служить случаи, когда на биваленте всегда образуется хиазмаи она всегда локализована в одном и том же месте хромосомы. Такие крайние варианты локализованности хиазм известны для некоторых саранчовых ( Высоцкая, 1987;White,1973). В этом случае гены, расположенные дистальнее и проксимальнее локализованной хиазмы, в генетическом анализе будут показывать отсутствиесцепления, как если бы они принадлежали к разным хромосомам, поскольку частота кроссинговера между ними будет равна 0.5.

19. Методы, используемые для выявления изменений в структуре дефектных генов. Международная исследовательская программа «Геном человека». Технология рекомбинантных ДНК, конструирование химерных молекул ДНК и их клонирование. Полимеразная цепная реакция (ЦПР) и полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) как методы изучения генома диагностики болезней. Генная терапия.

Проект по расшифровке генома человека .— международный научно-исследовательский проект, главной целью которого было определить последовательность нуклеотидов, которые составляютДНКи идентифицировать 20–25 тыс.геновв человеческомгеноме.

Проект начался в 1990 году, под руководствомДжеймса Уотсонапод эгидойНациональной организации здравоохранения США(англ.). В 2000 годубыл выпущен рабочий черновик структуры генома, полный геном — в2003 году, однако и сегодня дополнительный анализ некоторых участков ещё не закончен.

Цели

Последовательность человеческой ДНК сохраняется в базах данных, доступных любому пользователю черезИнтернет.Национальный центр биотехнологической информацииСША (и его партнёрские организации в Европе и Японии) хранят геномные последовательности в базе данных известной какGenBank, вместе с последовательностями известных и гипотетических генов и белков. Другие организации, к примеруКалифорнийский Университет в Санта-Круз(англ.)^[7]иEnsembl(англ.)^[8]поддерживают дополнительные данные и аннотации а также мощные инструменты для визуализации и поиска в этих базах. Были разработаныкомпьютерные программыдля анализа данных, потому что сами данные без таких программ интерпретировать практически невозможно.

Процесс идентификации границ генов и других мотивовв необработанных последовательностях ДНК называетсяаннотацией генома(англ.) и относится к областибиоинформатики. Эту работу при помощи компьютеров выполняют люди, но они делают её медленно и, чтобы удовлетворять требованиями высокой пропускной способности проектовсеквенированиягеномов, здесь также всё шире используют специальные компьютерные программы. Лучшие на сегодняшний день технологии аннотации используют статистические модели основанные на параллелях между последовательностями ДНК и человеческимязыком, пользуясь такими концепциями информатики какформальные грамматики.

Другая, часто упускаемая из виду цель проекта «Геном человека» — исследование этических, правовых и социальных последствий расшифровки генома. Важно исследовать эти вопросы и найти наиболее подходящие решения до того, как они станут почвой для разногласий и политических проблем.

Все люди имеют в той или иной степени уникальные геномные последовательности. Поэтому данные, опубликованные проектом «Геном человека», не содержат точной последовательности геномов каждого отдельного человека. Это комбинированный геном небольшого количества анонимных доноров. Полученная геномная последовательность является основой для будущей работы по идентификации разницы между индивидуумами. Основные усилия здесь сосредоточены на выявлении однонуклеотидного полиморфизма.

Почти все цели, которые ставил перед собой проект, были достигнуты быстрее, чем предполагалось. Проект по расшифровке генома человека был закончен на два года раньше, чем планировалось. Проект поставил разумную, достижимую цель секвенирования 95 % ДНК. Исследователи не только достигли её, но и превзошли собственные предсказания, и смогли секвенировать 99,99 % человеческой ДНК. Проект не только превзошёл все цели и выработанные ранее стандарты, но и продолжает улучшать уже достигнутые результаты.

Получение рекомбинантных ДНК

Для получения таких молекул первоначально выделяют ДНК из 2 разных источников (рис. 4-65).

Каждую из них в отдельности фрагментируют, используя одну и ту же рестриктазу, расщепляющую ДНК с образованием "липких" концов. После процедуры нагревания и медленного охлаждения (отжига) наряду с исходными

216

молекулами ДНК_X и ДНК_Y могут образовываться рекомбинантные молекулы, состоящие из фрагментов ДНК_X и ДНК_Y связанных между собой "липкими" концами. Ковалентное сшивание фрагментов осуществляют с помощью ДНК-лигазы в присутствии АТФ как источника энергии.

Втехнологии рекомбинантных ДНК, кроме фрагментов ДНК, выделенных из клеток, содержащих ядра, используют ДНК, полученную с помощью обратной транскриптазы. При добавлении в реакционную среду 4 разных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов фермент на матрице мРНК по принципу комплементарности синтезирует ДНК-копию, или кДНК. Так как источником информации при образовании кДНК служит зрелая цитоплазматическая мРНК, то такая ДНК, в отличие от ДНК фрагментов, полученных при расщеплении геномной ДНК эукариотов, не содержит нитронов.

Рис. 4-65. Получение рекомбинантных ДНК. Два образца ДНК: ДНК_Х и ДНК_Y расщепляют одной и той же рестриктазой и получают фрагменты с "липкими" концами. При денатурации и последующем "отжиге" образуются рекомбинантные молекулы ДНК_А и ДНК_Б, первоначально соединённые друг с другом за счёт "липких" концов, затем сшиваемых ДНК-лигазой.

Клонирование ДНК

Для получения значительных количеств интересующего нас материала проводят клонирование ДНК, предполагающее встраивание нужного нам фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (или вектор). Вектор обеспечивает проникновение этой рекомбинантной, или химерной, ДНК в бактериальные клетки. В качестве векторов используют плазмиды, фаги, ретро- и аденовирусы. Особенно часто в качестве вектора служит плазмидная ДНК.

Плазмиды - небольшие кольцевые двухце-почечные молекулы ДНК, присутствующие в бактериальных клетках в различном количестве копий. Они имеют автономную систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в клетках на определённом уровне - от нескольких единиц до нескольких сотен копий геномов на клетку.

Используемую для клонирования плазмидную ДНК и интересующую нас ДНК расщепляют по определённому участку рестриктазой, получают рекомбинантную ДНК, возвращают гибридную плазмиду в кольцевую форму и вводят в бактериальные клетки, т.е. осуществляют трансформацию бактерий. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий введённого в плазмиду фрагмента ДНК, т.е. таким способом чужеродный

для бактерий генетический материал может быть получен в значительных количествах (рис. 4-66).

В качестве клонирующих векторов часто используют фаги. Если экзогенную ДНК вводят в эукариотические клетки, то эту процедуру называют трансдукцией.

Полимеразная цепная реакция

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предложенный в 1983 г. Карри Муллисом (Нобелевская премия, 1993 г.), явился эпохальным

открытием XX века в области молекулярной биологии. Он позволяет подвергать специфичной амплификации в условиях in vitro (в пробирке) участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК. Необходимое условие для проведения ПЦР - знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области. Участок исследуемой ДНК гибридизуют с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигодезоксирибонуклеотидными последовательностями длиной от 15 до 30 пар нуклеотидов, которые комплементарны 3'-концам амплифицируемого участка на кодирующей и некодирующей нитях ДНК. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза продуктов ПЦР используют любой тип ДНК: геномную ДНК человека, различных видов про- и эукариотов, ДНК, выделенную из культур клеток, "библиотек" генов и других источников. Метод не требует больших количеств исследуемой ДНК, в принципе, достаточно даже одной молекулы, содержащейся в одном волосе на голове, одной капле крови или спермы.

Успех в разработке метода в значительной степени обусловлен использованием в качестве фермента термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

Реакционная смесь для получения интересующей нас ДНК содержит исследуемую ДНК, субстраты реакции - 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную, или Taq-полимеразу и буфер, содержащий ионы Mg²⁺.

Один цикл полимеризации включает 3 этапа (рис. 4-67):

• плавление: на этой стадии реакционную смесь нагревают до температуры 90-97 °С. Исследуемая двуцепочечная ДНК денатурирует и переходит в однонитевую форму;

• гибридизация или отжиг ДНК с праймерами. В результате снижения температуры до 50-60 °С происходит комплементарное связывание праймеров с цепями матричной ДНК и образование двухцепочечного участка на каждой из нитей ДНК;

• элонгация, удлинение нитей ДНК, комплементарных матричной ДНК, катализирует Taq-полимераза в направлении от 5'- к 3'-концу.

Затем снова наступает этап плавления, когда за счёт повышения температуры синтез ДНК прекращается, и двунитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК денатурирует. Во втором и последующих циклах праймеры гибридизируются с исходной матричной ДНК и с вновь синтезированными молекулами ДНК, количество которых нарастает в геометрической прогрессии. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не из-за изменения температурного режима, а по достижении ДНК-полиМеразой границы амплифицированного участка, что определяет строго определённый размер продукта с точностью до одного нуклеотида.

Каждый из этапов цикла имеет продолжительность от десятков секунд до 1-3 мин, в результате полный цикл длится от одной до нескольких минут.

Описанную процедуру амплификации ДНК проводят в автоматическом режиме в приборе - циклизаторе, или термоциклере, амплификаторе ДНК. Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.

С помощью ПЦР можно получить достаточное количество копий участков ДНК, в которых предполагаются присутствие мутаций, полиморфизм сайтов, можно проводить ДНК-диагностику инфицированности пациентов вирусными, бактериальными и грибковыми возбудителями болезней.

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

Мутации, возникающие в участках узнавания определённых рестриктаз, делают эти участки ДНК нечувствительными к действию ферментов. Это может быть легко обнаружено по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК. ПДРФ-анализ включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, её рестрикцию специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию этих фрагментов путём блот-гибридизации по Саузерну. На электрофореграммах при отсутствии рестрикции в исследуемой ДНК выявляют один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними участками рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном участке на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным участком рестрикции и одним из ближайших постоянных участков рестрикции (рис. 4-68).

ПДРФ-анализ может быть значительно упрощён в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путём проведения ПЦР и рестрикции амгошфицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки рестриктазой. Если участок узнавания не изменён, обработка ферментом приведёт к образованию 2 маленьких фрагментов с той же суммарной длиной, что и исходный фрагмент.

При обследовании пациентов и членов их семей на носительство патологических генов широко используют этот метод, с помощью которого:

• идентифицируют делеции в гене дистрофина, на долю которых приходится около 60% всех мутаций, вызывающих миодистрофию Дюшенна;

• диагностируют гемофилию А, некоторые та-лассемии, ретинобластому и гранулематоз;

• контролируют здоровье детей в семьях, в которых родители являются гетерозиготами по гену серповидно-клеточной анемии и другим дефектным генам.