5. Определение первичной последовательности полипептидов.

Основные этапы: выделение белка — определение молекулярной массы и субъединичного состава — определение АК состава — определение концевой АК (обычно N-конец) — деградация белка с получением коротких фрагментов — определение АК последовательности (секвенирование) — сборка фрагментов и установление последовательности.

1. Получение: различие в свойствах.

— дезинтегрирование исходного материала и получение экстракта с белком, белок переводят в раствор, потом фильтруют или центрифугируют;

— осаждение белков из раствора добавлением нейтральной соли (NH₄)₂SO₄. Это увеличивает ионную силу раствора, и гидрофобные белки осаждаются (высаливание);

— хроматография: взаимодействие вещества в подвижной фазе (жидкость или газ) с поверхностью неподвижной фазы (адсорбент), в результате образуются фракции с отдельными веществами. (Хроматография, потому что впервые на экстракте листа и на его пигментах.)

2. Определение молярной массы: эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация, проверка по проницаемости твердой фазы), гель-электрофорез (заряженная молекула движется в постоянном электрическом поле в определенном направлении, молекулы одинакового размера образуют зоны), масс-спектрометрия (движение заряженных частиц в магнитном поле).

3. Определение АК состава: полный гидролиз до свободных АК (инкубирование в 6 М HCl при 106 градусах), а затем анализ с помощью колоночной хроматографии (перевод в окрашенные соединения реакцией с красителями).

4. Определение концевой АК с помощью направленной химической модификации. Реакция N-концевой с дансилхлоридом или C-концевой с динитрофторбензолом с последующим полным гидролизом белка до АК. Далее хроматография: дансильные производные с флюоресценцией, динитрофенильные ярко-желтые.

5. Направленная деградация белка с помощью протеаз, расщепляющих полипептидную цепь в определенных участках (по конкретным остаткам). Трипсин — только по основным, лизинам или аргининам. Остатки разделяют с помощью хроматографии и секвенируют отдельно.

6. Для секвенирования обрабатывают фенилизотиоцианатом, он взаимодействует с аминогруппой на N-конце с отщеплением концевой АК, другие не трогает. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное идентифицируют хроматографией. Процедуру повторяют, идентифицируют следующую АК и так до конца. Секвенирование Эдмана.

7. Для установления последовательности исходного белка проводят сборку фрагментов, учитывая условия их получения при гидролизе, начиная с C-концевой АК.

БИОХИМИЯ БИЛЕТЫ #6-12 (нуклеотиды)

6. Нуклеозиды и нуклеотиды как компоненты нуклеиновых кислот: структура, физические и химические свойства

Нуклеотиды — сложные эфиры нуклеозидов и фосфорных кислот. Нуклеозиды — гликозиды с гетероциклическим фрагментом и с остатком сахара.

Нуклеиновые кислоты — линейные полимерные молекулы из нуклеотидов. Каждый нуклеотид: гетероциклическое основание, углеводный остаток и остаток фосфорной кислоты.

О снования: 6-членные, пиримидины (тимин Thy T, урацил Dra U, цитозин Cyt C) и 5- 6- членные пуриновые (аденин Ade A и гуанин Gua G). Азота много, слабый основный характер — азотистые основания. Поглощают УФ при 260 нм.

У глеводные остатки: рибоза и дезоксирибоза (через гликозидную связь). Основания + углеводные остатки = нуклеозид: аденозин, гуанозин, тимидин, уридин, цитидин. Нуклеозиды с рибозой — рибонуклеозиды (все, кроме тимидина), с дезоксирибозой — дезоксирибонуклеозиды (все, кроме урацила).

О статки фосфорной кислоты: трехосновная, при взаимодействии со спиртами может образовывать моно- ди- и триэфиры. У рибонуклеозидов гидроксилов 2, у дезоксирибо — 3. У РНК только 3'-5' связь.

Остаток фосфорной кислоты — диэфир, а третья кислотная группа свободна и в водной среде диссоциирует; в результате все молекулы нуклеиновых кислот сильно отрицательно заряжены и представлены в виде солей одно- двухвалентных металлов.