Изучение спектров поглощения биологических объектов

Наиболее важными параметрами спектров поглощения являются положения максимумов спектра на шкале длин волн (λ_max нм, ν_max см ^-1), полуширина полос поглощения Δλ_1/2, или Δν_1/2 (измеряются на половине высоты максимума), величина максимумов D_max, а если их несколько, то и соотношение между ними.

Измерение спектров поглощения биологических препаратов существенно отличается от измерения спектров растворов веществ. Неравномерное распределение вещества по объему (например, весь хлорофилл листа или суспензии находится только в хлоропластах) приводит к тому, что часть света проходит мимо частиц (не поглощаясь). Такой эффект, называемый эффектом проскока (или сита), увеличивает интенсивность прошедшего света, а значит, пропускание Т.

Вследствие гетерогенности биологических образцов появляется сильное светорассеяние. Рассеянный свет не попадает на фотоприемник прибора, поэтому наблюдается кажущееся увеличение D.

Совместное действие светорассеивания и эффекта сита искажает измеряемый спектр поглощения, сглаживает максимумы и уширяет полосы поглощения. Для уменьшения этих эффектов необходимо использование более тонких и гомогенных образцов и сред с более близкими к частицам коэффициентами преломления (например, добавление 60% глицерина к водным суспензиям частиц или клеток).

Уменьшение влияния светорассеивания на спектр поглощения достигают также увеличением телесного угла светосбора фотоприемника. Для этого приближают рассеивающий образец к фотоприемнику или помещают образец внутрь сферы, которая покрыта изнутри составом с высоким коэффициентом отражения (сфера Ульбрихта). Рассеянный свет, многократно диффузно отразившийся от сферы, попадает на фотоприемник, вмонтированный внутри сферы. Уменьшение светового потока в таком случае будет объясняться только поглощением света образцом. Если же применение сферы невозможно, используют светорассеивающую пластинку из матового стекла или кварца, которая помещается на пути одного из лучей для компенсации рассеяния света объектом, установленным на пути второго луча.

Светорассеяние для молекулярных растворов веществ зависит от длины волны измеряемого света, резко возрастая в коротковолновой области, но в случае сильно гетерогенных образцов с более крупными частицами светорассеяние практически равномерно по спектру. Поэтому, оценивая оптическую плотность, обусловленную поглощением образца, следует вычитать из измеряемой величины долю светорассеяния D_p. Величина светорассеяния определяется для тех длин волн, на которых отсутствует поглощение света веществом, и экстраполируется на исследуемую область. Тогда истинное поглощение по правилу аддитивности определяется как D_n = D_общ - D_p.

Ход работы

Задание 1. Спектры поглощения и идентификация растительных пигментов

В хлоропластах растений присутствуют несколько видов пигментов: каратиноиды, хлорофилл "а", хлорофилл "б" и др. Они отличаются по спектрам поглощения. Пользуясь справочными данными, можно практически отождествить тот или иной пигмент растения. Для проведения опыта необходимо собрать несколько листьев какого-либо растения.

А. Измерьте спектр поглощения зеленого листа растения. Для этого необходимо достать из ящика СФ-14 круглую кювету вместе с соответствующим держателем. Поместите кювету в держатель, положите в нее лист. Лист не должен быть оптически плотным и должен прикрывать все пространство кюветы. Если лист не помещается, обрежьте его ножницами. Приготовленный образец в держателе поместите в левое отверстие на верхней части сферы. В правое отверстие поставьте пустую кювету в держателе. Закройте крышку кюветного отделения и запишите спектр поглощения листа по D). Отметьте на бланке название растения. Бланк не снимайте. То же проделайте в прямоугольной кювете.

Б. Разотрите несколько листьев в ступке. Добавьте в ступку несколько миллилитров воды, тщательно перемешайте и полученный гомогенат профильтруйте через два слоя марли на воронке. Приготовленный водный гомогенат содержит более или менее обогащенную фракцию хлоропластов. Разбавьте гомогенат водой, чтобы его поглощение при 680 нм было в области 0,5 - 1,0 шкалы D. Для этого включенный прибор СФ-14 необходимо ручкой развертки длин волн вывести на длину 680 нм. Установив длину волны, поставьте прямоугольную кювету (1 см толщиной) с гомогенатом в держателе в кюветное отделение слева. В правое отделение поместите кювету с водой. Опустите крышку кюветного отделения. Измерения проводите по оптической плотности D. Если при длине волны 680 нм величина D значительно превышает 1,0, то гомогенат следует разбавлять водой до тех пор, пока оптическая плотность гомогената не окажется в рекомендуемом интервале. После того как подобрана оптическая плотность гомогената, измерьте спектр поглощения по D на бланке от предыдущего упражнения в пределах 400 - 750 нм. Записанный спектр пометьте. Бланк не снимайте. Кюветы тщательно вымойте. Запишите спектр поглощения гомогената в круглой кювете.

В. Ножницами измельчите два - три листа и поместите в ступку. Добавьте несколько миллилитров 80 %-ного ацетона (или этилового спирта) и тщательно разотрите содержимое. Полученный экстракт профильтруйте на воронке через бумажный фильтр. Если раствор получается мутным, профильтруйте еще раз. Экстракт содержит хлорофиллы "а", "б" и каротиноиды. Разбавьте экстракт 80 %­ным ацетоном (или спиртом) так, чтобы его поглощение при 650 нм было в пределах 0,5 - 1,0 шкалы D (процедуры те же, что и в упражнении Б). Запишите спектр приготовленного раствора на шкале оптических плотностей для 1 см прямоугольной кюветы на бланке от предыдущих упражнений задания 1. Пометьте спектр. Кюветы тщательно промойте. Запишите спектр в круглой кювете.

После выполнения задания 1 идентифицируйте пигменты, пользуясь справочными данными (положение максимумов, форма и число полос). Сравнивая спектр поглощения ацетонового (спиртового) экстракта со спектрами гомогената (хлоропластов) и целого листа, покажите различия спектральных свойств молекул хлорофилла в хлоропласте и в растворе (по положению максимумов, их полуширине). Исходя из положения максимумов поглощения хлорофилла "а", постройте схему энергетических уровней молекулы хлорофилла "а". Объясните зависимость спектров от выбранной кюветы.