- •Молекулярно-генетические методы анализа и применение их в клинической практике врача
- •Поиск изменений последовательностей нуклеиновых кислот и белков на молекулярном уровне является одним из
- •Существует достаточно большое количество молекулярно-генетических методов, которые имеют широкий спектр применения. Однако многие
- •Классическая ПЦР может быть использована для получения фрагментов ДНК, которые далее можно исследовать
- •Секвенирование позволяет определить нуклеотидную последовательность ДНК. В связи с этим данный метод активно
- •В классическом протоколе секвенирования с помощью этого метода предлагается проводить 4 реакции, в
- •Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
- •Хромогенная in situ гибридизация (CISH)
Секвенирование позволяет определить нуклеотидную последовательность ДНК. В связи с этим данный метод активно применяется для выявления генных мутаций при моногенных заболеваниях. Наиболее используемый вариант секвенирования известен также как метод Сэнджера. Как правило, перед секвенированием проводят ПЦР с целью увеличения концентрации ДНК фрагмента, последовательность которого необходимо определить. Далее, к однонитевой (денатурированной) молекуле ДНК присоединяется прямой и обратный праймеры и с помощью ДНК полимеразы проводят синтез новой молекулы ДНК на базе дидезоксинуклеозидтрифосфатов и немодифицированных единичных нуклеотидов
В классическом протоколе секвенирования с помощью этого метода предлагается проводить 4 реакции, в каждой из которых реакционная смесь содержит три немодифицированных нуклеотида и один дидезоксинуклеозидтрифосфат. Поскольку полимеризация ДНК будет каждый раз заканчиваться на дидезоксинуклеозидтрифосфате, то в каждой смеси будут находиться фрагменты разных размеров, соответствующие исследуемой последовательности, оборванной на нуклеотиде, замещенном дидезоксинуклеозидтрифосфатом. Затем результаты 4- х реакций анализируются с помощью электрофореза, складывая их, восстанавливается исходная последовательность ДНК. В настоящее время, благодаря созданию высокоразрешающих систем детекции, для секвенирования используются другие способы проведения реакции и анализа конечных результатов. Однако принцип метода остается прежним.
Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
Флуоресце́нтная гибридиз цияа́ in situ, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization — FISH), — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.
Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике, в диагностике онкологических заболеваний, в ретроспективной биологической дозиметрии.
FISH является «золотым стандартом» в исследованиях амплификации гена HER2.
Впервые in situ гибридизация была описана Gall J. G., Pardue M. L. в 1969 году с использованием 32Р- меченного зонда.