Антипов А.А.. Патогенетические механизмы развития, диагностика и профилактика алиментарной железодефицитной анемии поросят

На правах рукописи

АНТИПОВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ, ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА АЛИМЕНТАРНОЙ ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНОЙ АНЕМИИ ПОРОСЯТ

06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

Автореферат

диссертации на соискание учѐной степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 2013

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель:

Жаров Александр Васильевич - доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор, профессор кафедры общей патологии имени В.М. Коропова ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина».

Официальные оппоненты:

Сноз Григорий Васильевич - доктор ветеринарных наук, профессор, профессор кафедры диагностики болезней и терапии животных ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина».

Симонян Грант Айказович - доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории лейкозологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко».

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Самарская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится «___»________________20___ г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.02 в ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» по адресу: 109472,г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. [phone]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» (109472,г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23) и на сайтах: http://vak2.ed.gov.ru и http://www.mgavm.ru

Автореферат разослан «___»___________20___ г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Л.Ф. Сотникова

2

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Алиментарная железодефицитная анемия является одной из самых распространѐнных болезней обмена веществ поросят, возникающей вследствие малого запаса железа в организме новорождѐнного поросѐнка, высокой потребностью в этом микроэлементе у интенсивно растущих животных в сочетании с низким содержанием железа в молоке и молозиве свиноматок (Карелин А.И., 1983; Кальницкий Б.Д., 1985; Заволокина А.А., Бережной А.Ф., 1988;Кондрахин И.П., 1989; Карпуть И.М., 2003; Шахов А.Г., Мисайлов В.И., Шундулаев Р.А., 2004).

Дефицит железа приводит к угнетению кроветворения и расстройству ферментных систем организма, в результате чего развивается смешанная гипоксия, метаболические и функциональные нарушения в органах, тканях и клетках организма (Карелин А.И., 1983; Карпуть И.М., 2003; Метлякова М.Ю., 1998; Николадзе М.Г., 2002; Casassus P., 2001; Killip S., Bennett M.D.,

2007).

Внастоящее время для лечения и профилактики железодефицитной анемии применяют препараты железа для энтерального и парентерального введения (Пантелеев С.В., 1994; Васильева Н.С., 1996; ХазиповН.З.ссоавт., 1992, 1997; 2000; Карпуть И.М., 2003; Гуревичев П.А., Дельцов А.А., Уразаев Д.Н., 2007).

Вместе с тем известно, что неблагоприятным моментом является не только недостаток железа, но и его избыток, поскольку, являясь металлом с переменной валентностью, железо в ряде биохимических реакций приводит к образованию активных форм кислорода, которые оказывают разрушающее действие на биологические структуры (Коган А.Х., Ершов В.И., Алекперова Г.Р., 1991; Ништ И.П., 1999; Владимиров Ю.А., 2000; Зенков Н.К., 2001;

Wills E.D., 1972; Minotti, G. andAust, S. D., 1987; Droge W., 2001.; Kurtoglu E., Ugur A., Baltaci A.K., Undar L., 2003; Lim C.S., 2004).

Однако вопросы, касающиеся морфологических изменений в органах и тканях поросят больных алиментарной железодефицитной анемией, особенно на ранних стадиях развития болезни, и влияние препаратов железа на морфологию органов поросят остаются недостаточно изученными. Также остаѐтся открытым вопрос о роли свободно-радикальных процессов в патогенезе болезни и участие их в формировании основных структурных изменений в организме.

Цель и задачи исследований. Целю наших исследований являлосьвыявление морфологических и морфометрических изменений печени, почек, селезѐнки и лимфатических узлов, а также определение интенсивности течения процессов свободнорадикального перекисного окисления липидов и состояние системы антиоксидантной защиты у поросят при алиментарной железодефицитной анемии и после парентерального введения железодекстранового препарата.

Всоответствии с целью были поставлены следующие задачи:

3

1.Установить качественные и количественные морфологические изменения печени, почек, селезѐнки и лимфатических узлов поросят при алиментарной железодефицитной анемии;

2.Определить показатели свободнорадикального перекисного окисления липидов и состояние антиокислительной активности сыворотки крови поросят при алиментарной железодефицитной анемии;

3.Оценить влияние препарата трѐхвалентного железа «Ферранимал-75» в профилактической дозе на качественные и количественные морфологические изменения печени, почек, селезѐнки и лимфатических узлов поросят;

4.Провести оценку влияния препарата «Ферранимал-75» в профилактической дозе на показатели перекисного окисления липидов и антиокислительной активности сыворотки крови поросят.

Научная новизна. Впервые с применением клиникогематологических, патологоанатомических, гистологических и морфометрических методов проведена комплексная оценка функциональной морфологии печени, почек, селезѐнки и лимфатических узлов подсосных поросят при алиментарной железодефицитной анемии на ранних этапах еѐ развития, и после применения в профилактической дозе железодекстранового препарата «Ферранимал-75».

Выявлены морфологические изменения печени, почек, селезѐнки и лимфатических узлов, подтверждающие нарушение формирования иммунной системы, а также начале развития почечной и печѐночной недостаточности при алиментарной железодефицитной анемии. Установлены основные структурные элементы в исследуемых органах, которые первыми подвергаются патогенному воздействию гипоксии и сидеропении, развивающихся при железодефицитной анемии.

Раскрыты положительные и отрицательные эффекты железодекстрановых препаратов на морфофункциональное состояние изучаемых органов. Изучено распределение железа в исследуемых органах после внутримышечного введения поросятам железодекстранового препарата «Ферранимал-75» в профилактической дозе.

С помощью физико-биохимических методов (спектрофотометрии) установлено влияние избытка и недостатка железа на интенсивность свободнорадикального перекисного окисления липидов и антиокислительную активность сыворотки крови подсосных поросят при алиментарной железодефицитной анемии и после применения в профилактической дозе железодекстранового препарата «Ферранимал-75».

Теоретическая и практическая ценность. Полученные результаты расширяют и углубляют имеющиеся в настоящее время данные о патогенезе алиментарной железодефицитной анемии. Выявленные структурные изменения в органах, тканях и клетках поросят, больных алиментарной железодефицитной анемией на ранних стадиях развития болезни, рекомендуется использовать в качестве морфологических критериев оценки

4

исследуемых систем органов, при постановке патологоанатомического диагноза, а также при разработке, применении и внедрении препаратов для лечения и профилактики этой болезни. Раскрыты морфологические изменения в органах иммунокомпетентной системы, подтверждающие нарушение формирования иммунной системы при анемии с развитием комбинированного Т- и В-клеточного иммунодефицита. Даны морфологические подтверждения альтеративных процессов в печени и почках поросят при алиментарной железодефицитной анемии, что свидетельствует о снижении адаптационных возможностях изучаемых органов и следует учитывать при лечении этой болезни.

В тоже время, результаты исследований раскрывают некоторые побочные эффекты железодекстрановых препаратов, связанные с резким усилением интенсивности перекисного окисления липидов при их применении, в результате чего происходит повреждение клеток крови, эндотелия сосудов и паренхиматозных элементов изучаемых органов. Эти сведения имеют значение при разработке новых, наиболее эффективных и безвредных лекарственных средств для лечения и профилактики железодефицитной анемии, которые будут с одной стороны восполнять дефицит железа и положительно воздействовать на кроветворение, а с другой стороны будут иметь минимальные побочные эффекты на системы органов и их функции.

Полученные результаты исследований рекомендуется использовать ветеринарным специалистам для лечения и профилактики алиментарной железодефицитной анемии, а также при коррекции побочных эффектов, возникающих после применения железосодержащих препаратов.

Ряд положений диссертации могут быть использованы при написании учебных пособий и руководств, в учебном процессе на ветеринарных, зооинженерных и биологических факультетах.

Материалы исследования используются в научных и учебных целях на кафедре общей патологии и кафедре фармакологии и токсикологии им. И.Е. Мозгова Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1.Результаты патологоанатомических, гистологических и морфометрических исследований печени, почек, селезѐнки и лимфатических узлов подсосных поросят, больных алиментарной железодефицитной анемией;

2.Показатели интенсивности свободнорадикального перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы у подсосных поросят при алиментарной железодефицитной анемии;

3.Данные патологоанатомических, гистологических и морфометрических исследований, отражающие влияние железодекстранового препарата

5

«Ферранимал-75» на морфологию печени, почек, селезѐнки и лимфатических узлов подсосных поросят;

4.Показатели интенсивности свободнорадикального перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы у подсосных поросят после внутримышечного введения им железодекстранового препарата «Ферранимал-75».

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и

обсуждены на XVIII Международной научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 2006), 17-ой Всероссийская научно-методическая конференция по патологической анатомии «Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных» (Москва, 2011) и на Международной Российско-Чешской научно-практической конференции молодых учѐных и специалистов «Актуальные вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии» (Москва, 2012).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 5 в журналах рекомендованных ВАК РФ, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемой проблеме.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 162

страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, выводов, практических предложений и рекомендаций, а также библиографического списка. Библиографический список включает 239 источников, в том числе 93 иностранных. Диссертация содержит 6 таблиц и 55 рисунков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена с 2006 по 2013 год на кафедре патологической анатомии в содружестве с кафедрой фармакологии и токсикологии им. И.Е. Мозгова и кафедрой радиобиологии, рентгенологии и гражданской обороны им. академика А.Д. Белова ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», а также на базе свиноводческого комплекса АПК «Шатурский» филиале ОАО «Мосэнерго» Шатурского района Московской области.

Исследования проведены на 45 поросятах клинически здоровых поросятах крупной белой породы, обоего пола в период от рождения до достижения ими 14-дневного возраста. Животные для проведения экспериментов подбирались в группы по принципу аналогов с учетом пола, возраста, породы и массы тела. На всѐм протяжении опыта животные находились в одинаковых условиях кормления и содержания. В опытах был использован новый препарат «Ферранимал-75», синтезированный научнопроизводственной фирмой «А-Био».

6

В соответствии с задачами проводимого исследования, а также по клинико-гематологическим показателям животные были разделены на 3 группы:

Контрольная группа - клинически здоровые поросята с гематологическими показателями в пределах нормы (15 поросят);

Первая опытная группа – поросята с клиническими и гематологическими признаками гипохромной микроцитарной анемии (15 поросят);

Вторая опытная группа – поросята после внутримышечного введения им профилактической дозы железодекстранового препарата «Ферранимал-

75» (15 поросят).

Научная работа включала в себя следующие пункты:

1.Клиническое обследование животных с применением общих методов исследования;

2.Гематологические исследования, с определением количественных и качественных изменений эритроцитов;

3.Физико-биохимические исследования сыворотки крови с определением продуктов перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы;

4.Патоморфологические исследования с ведением протоколов вскрытия подопытных животных;

5.Патогистологические исследования с приготовлением и анализом гистологических срезов печени, почек, селезѐнки и лимфатических узлов.

Кровь для исследования от поросят получали один раз за время

проведения опыта по достижении поросятами 14-ти дневного возраста. Проводили гематологические исследования с помощью ветеринарного гематологического анализатора ABC VET. Учитывали количество эритроцитов, гемоглобина и среднее содержание гемоглобина в одном эритроците. Исследование морфологии клеток крови проводили с помощью метода приготовления мазков крови на предметном стекле с последующей окраской по Романовскому-Гимзе. Отмечали изменение морфологии эритроцитов в виде пойкилоцитоза, анизоцитоза и анизохромии.

Убой подопытных животных производили на убойном пункте АПК «Шатурский» Московской области. Животные были умерщвлены в научных целях по окончанию опыта методом неполной декапитации и обескровливания по достижении поросятами 14-ти дневного возраста. Вскрытие производили на убойном пункте вышеуказанного хозяйства. Результаты макроскопического исследования туш и органов оформляли протоколами.

Материалом для гистологических исследований служили селезѐнка, лимфатические узлы (подчелюстные, заглоточные латеральные, дорсальные поверхностные шейные), печень и почки поросят, которые фиксировали в 10%-ом водном растворе нейтрального формалина. Образцы органов заливали в парафин и готовили гистологические срезы толщиной 5-7 мкм на

7

микротоме МПС-2 по общепринятым методикам (Лилли Р., 1969, Меркулов Г.А., 1969) с последующим их окрашиванием для обзорных целей гематоксилином Майера и эозином, на соединительную ткань по Массону и для выявления соединений железа (III) по Перлсу.

Весь материал исследовали с использованием биологического микроскопа ScienOpBP-20 при увеличении окуляров 7х, 10х и объективов 4х, 10х и 40х. Фотографировали цифровой камерой-окуляром для микроскопа

DCM1300 (1300 pixels, USB2.0).

В качестве критериев оценки функциональной морфологии изучаемых органов были взяты следующие морфометрические параметры:

печень – объѐмная плотность стромы и паренхимы, средний диаметр гепатоцитов и их ядер, средняя площадь гепатоцитов и их ядер, ядерноцитоплазматическое отношение гепатоцитов, количество двуядерных гепатоцитов и апоптозных телец на тестовую площадь (увеличение х70) в 30 полях зрения.

почки – объѐмная плотность почечных телец, канальцев и стромы органа, количество функционирующих клубочков на тестовую площадь в 30 полях зрения (увеличение х70), средняя площадь сосудистых клубочков, средняя площадь мочевого пространства в почечном тельце, высота нефроцитов проксимального и дистального канальцев, собирательных трубочек и петли Генле.

селезѐнка – объѐмная плотность стромы, белой и красной пульпы, средний диаметр центральной артерии, средняя площадь фолликулов и их реактивных центров.

лимфатические узлы – объѐмная плотность коркового и мозгового вещества, паракортикальной зоны, синусов и стромы, средняя площадь лимфоидных узелков и их реактивных центров.

Морфометрию проводили с использованием программы ImageJ Национального института здоровья (США) с набором модулей для медицинской морфометрии и при помощи окуляр-микрометра. Объѐмную плотность измеряли методом «точечного счета» с помощью окулярной стереометрической сетки, с количеством точек равным 361 при общем увеличении х70. Измерения проводились в 30 последовательных полях, равных площади окулярной сетки.

Физико-биохимические исследования сыворотки крови были проведены на спектрофотометре «СФ-26». Интенсивность перекисного окисления липидов оценивали путѐм определения концентрации диеновых и триеновыхконъюгатов, а также ТБК - активных продуктов. Состояние антиоксидантной системы организма поросят оценивали с помощью показателя интегральной антиокислительной активности сыворотки крови по степени подавления липопероксидацииinvitro.

Все полученные цифровые данные обрабатывали методами математической статистики, принятой в биологии и медицине (Лакин Г.Ф., 1990), с использованием программы MicrosoftExcel на РС. Вероятность

8

различия между двумя средними при малых выборках определяли по таблице Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Клинико-гематологические и патологоанатомические изменения у поросят в норме, при алиментарной железодефицитной анемии и под влиянием препарата «Ферранимал-75»

На протяжении всего эксперимента у поросят контрольной группы не наблюдалось каких-либо расстройств общего клинического состояния.

К 14 дню жизни у поросят первой опытной группы наблюдались классические признаки анемии в виде заметного отставания в росте и развитии, неудовлетворительной упитанности, бледности кожи и слизистых оболочек, учащения пульса и дыхания.

У поросят второй опытной группы значительных нарушений общего клинического состояния обнаружено не было, отмечалась лишь болезненность при пальпации в области введения препарата и умеренное увеличение регионарных лимфатических узлов.

При сравнении среднесуточного и общего прироста массы тела поросят контрольной и опытных групп, установлено достоверное (р≤0,01) увеличение среднесуточного прироста поросят, получавших железосодержащие препараты и снижение массы поросят (р≤0,01) с клиническими признаками железодефицитной анемии (таблица 1).

					Таблица 1
		Среднесуточный прирост и масса тела поросят
		Масса поросят	Масса поросят в	Масса поросят в	Среднесуточный
	Группа	при рождении,
			4 дня, кг	14 дней, кг	прирост, г
		кг
	1	2	3	4	5
	Контроль	1,31±0,12	1,52±0,16	3,25±0,20	141,4±8,6
	Первая опытная	1,28±0,17 **	1,5±0,16 **	2,2±0,17 *	60,4±8,7 *
	группа
	Вторая опытная	1,25±0,06 **	1,65±0,12 **	3,60±0,12 *	167,1±9,4 *
	группа

Примечание: * р≤0,01; ** - различия не достоверны.

Анализ крови 14-ти дневных поросят (таблица 2) позволил судить о достоверном изменении содержания гемоглобина (р≤0,01) и эритроцитов (р≤0,05) у поросят всех экспериментальных групп. Наиболее низкие показатели количества гемоглобина, эритроцитов и среднего содержания гемоглобина в одном эритроците были в первой опытной группе, тогда как во второй опытной группе животных эти показатели были значительно выше. При изучении морфологии эритроцитов в мазке периферической крови отмечали наличие гипохромии и микроцитоза эритроцитов у животных первой опытной группы. В мазках крови животных второй опытной группы наблюдали увеличение количества гиперхромныхмакроцитов. Отдельные

9

эритроциты были в состоянии дегенеративных изменений. В мазке крови поросят контрольной группы значительных изменений в морфологии эритроцитов не отмечалось.

			Таблица 2
Гематологические показатели поросят контрольной и опытных групп в
	возрасте 14 дней
			Среднее содержание
Группы	Гемоглобин, г/л	Эритроциты, ×1012/л	гемоглобина в одном
			эритроците, пг
1	2	3	4
Контрольная	83,9±6,5	4,9±0,60	17,0±1,5
Первая опытная	60,6±5,6 *	4,26±0,64 **	14,27±1,1 **
Вторая опытная	110,5±3,5 *	5,4±0,53 **	20,4±0,8 **

Примечание: * р≤0,01; ** р≤0,05.

При послеубойном осмотре трупов поросят контрольной группы не было обнаружено каких-либо существенных отклонений в морфологии внутренних органов.

В первой опытной группе животных при вскрытии обращали на себя внимание истощение животных, бледность скелетных мышц и слизистых оболочек внутренних органов, белковая и жировая дистрофии паренхиматозных органов, а также заметное уменьшение в размере органов кроветворения: тимуса, селезѐнки и лимфатических узлов.

Изменения в органах обнаруженные при вскрытии поросят второй опытной группы, характеризуются умеренной гиперплазией лимфоидной ткани кроветворных и иммунокомпетентных органов, пигментацией их паренхимы и артериальной гиперемией. Других существенных отклонений в морфологии внутренних органов не обнаружено.

3.2 Сравнительная гистологическая и морфометрическая характеристика печени поросят в норме, при алиментарной железодефицитной анемии и под влиянием препарата «Ферранимал-75»

Данные гистологических исследований показывают, что при алиментарной железодефицитной анемии развиваются альтеративные и компенсаторные процессы в паренхиматозных и иммунокомпетентных органах (печени, почках, селезѐнке и лимфатических узлах).

Повреждения печени имеют определенные топические особенности, что отображает структурную и функциональную неоднородность этого органа. Наиболее выраженные патоморфологические изменения наблюдаются в наиболее чувствительных к гипоксии центролобулярныхгепатоцитах (Агаджанян H.A., 1987), которые находятся в состоянии белковой, жировой и углеводной дистрофии. Поражение перипортальных и промежуточныхгепатоцитов происходит в меньшей

10