Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов

251

Рис. 12.2. Промышленный синтез L-аскорбиновой кислоты. Одна из стадий процесса, а именно превращение D-сорбитола в L-сорбозу, осуществляется при участии бактерии Acetobacter suboxydans, которая синтезирует фермент сорбитолдегидрогеназу. Остальные стадии представляют собой чисто химические реакции.

Е. coli (при этом синтезировалась активная 2,5-DKG-редуктаза), а затем переклонировали в векторе с широким кругом хозяев и трансформировали им Erwinia herbicola.

Трансформированные клетки Erwinia активно превращали D-глюкозу непосредственно в 2-KLG, при этом собственные ферменты Erwinia, локализованные во внутренней мембране бактериальной клетки, преобразовывали глюкозу в 2,5-DKG, а 2,5-DКG-редуктаза, локализованная в цитоплазме, катализировала превращение 2,5-DKG в 2-KLG (рис. 12.4). Таким образом, с помощью генетических манипуляций метаболические реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах, удалось осуществить в одном из них. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм можно использовать как фабрику для производства 2-KLG, заменяющую первые три стадии в том процессе получения L-аскорбиновой кислоты, который используется в настоящее время (рис. 12.2).

Коммерческую ценность 2,5-DKG-редуктазы можно повысить, если произвести аминокислотные замены, повышающие каталитическую активность фермента и его термостабильность. В то время, коша был идентифицирован ген 2.5-DKG-редуктазы, аминокислотные остатки, участвующие в образовании активного центра этого фермента, еще не были установлены. Однако, исходя из данных об аминокислотной последовательности фермента, была воссоздана его вторичная структура, состоящая из восьми тесно расположенных параллельных β-слоев, перемежающихся восемью α- спиралями, которые соединялись с β-слоями петлями разной длины (рис. 12.5). Такой характер укладки полипептидной цепи был установлен для 17 других ферментов с уже известной кристаллической структурой, и по аналогии с ними были идентифицированы три петли, возможно участвующие в связывании субстрата. С помо-

252

ГЛАВА 12

Рис. 12.3. Микробиологический синтез 2-KLG. Erwinia продуцирует три фермента, обеспечивающих синтез 2,5-DKG из D-

глюкозы, a Corynebacteriun - фермент,

катализирующий превращение 2,5-DKG e 2-KLG. Таким образом, 2-KLG, непосредственный предшественник L- аскорбиновой кислоты, можно синтезировать из D-глюкозы совместным культивированием этих двух микроорганизмов. Альтернативный подход состоит в создании рекомбинантной бактерии Erwinia, экспрессирующей ген соответствующего фермента

Corynebaclerium.

щью олигонуклеотид-направленного мутагенеза были получены 12 мутантных белков, каждый из которых содержал одну аминокислотную замену в одной из петель. 11 мутантных форм 2,5-DKG-редуктазы обладали более низкой удельной активностью, чем нативный фермент, а 12-я, у которой остаток глутамина в положении 192 был заменен на аргинин, была примерно в два раза более активной. По данным кинетических исследований, повышение активности было связано с увеличением в 1,8 раз максимальной скорости (Vmax) и уменьшением на 25% константы Михаэлиса (КM) реакции, катализируемой ферментом. Замена глициновых остатков в положениях 55 и 57 на аланиновые позволила получить более термостабильный фермент по сравнению с нативной формой. Дальнейшие усилия будут, вероятно, направлены на получение фермента, сочетающего оба этих свойства.

Синтез индиго

Множество бактерий, особенно бактерии вида Pseudomonas, способны утилизировать различные органические соединения типа нафталина, толуола, ксилола и фенола, которые являются для них единственным источником углерода. Очень часто гены ферментов, катализирующих расщепление этих органических соединений, располагаются в крупных природных плазми-дах (длиной 50—200 т.п.н.). Чтобы ставить эксперименты с этими бактериями, в частности проводить целенаправленную модификацию генов ферментов, катализирующих те или иные метаболические реакции, приходится предпринимать детальные генетические и биохимические исследования, и нередко в ходе этих исследований делаются неожиданные и весьма интересные открытия. Рассмотрим следующий пример. Плазмида NAH7 содержит два разных оперона, которые позволяют несущим ее псевдомонадам использовать нафталин как единственный источник углерода. Для характеристики соответствующих генов расщепили плазмидную ДНК с помощью HindIII и лигировали фрагменты с линеаризованной HindIII плазмидой pBR322. Полученные гибридные молекулы ввели в клетки Е. соli и отобрали трансформантов, устойчивых к ампициллину, но чувствительных к тетрациклину. Затем проверили всех трансформантов на способность образовывать нелетучие метаболиты — возможные продукты гидролиза радиоактивно меченного нафталина.

При исследовании одного из трансформантов, содержащего вставку длиной 10,5 т.п.н. и способного превращать нафталин в салициловую кислоту, обнаружилось, что минимальная ростовая среда, содержащая триптофан, приобретает синюю окраску. Тщательный анализ этого явления показал, что трансформированные клетки E. coli синтезировали краситель индиго. Синтез происходил в четыре стадии (рис. 12.6).

Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов

253

Рис. 12.4.

Превращение D-глюкозы в 2-KLG рекомбинантной бактерией Erwinia herbicola. Все участвующие в этом процессе ферменты обозначены буквой Ε и последовательно пронумерованы, указана также их клеточная локализация.

Рис. 12.5. Структура

2,5-DKG-peдуктазы,

воссозданная исходя из ее аминокислотной последовательности. Стрелки — β-слои, полоски -α-спиральные участки, кружки аминокислотные остатки, находящиеся на N- и С- концах молекулы или соединяющие ß-слои и α- спирали. Показаны три петли, возможно, участвующие в связывании субстрата. Желтый кружок — 192- й аминокислотный остаток.

254

ГЛАВА 12

1.Превращение триптофана в индол с помощью триптофаназы, которая синтезируется

вхозяйских клетках Е. coli.

2.Окисление индола до цис-индол-2,3-дигидродиола под действием нафталиндиоксигеназы, которая кодируется ДНК, переклонированной из плазмиды NAH7.

3.Спонтанная дегидратация.

4.Окисление на воздухе с образованием индиго.

Таким образом, комбинация ферментов двух разных метаболических путей двух разных организмов привела к неожиданному синтезу красителя индиго. Введение в Е. coli гена ксилолоксидазы, содержащегося в плазмиде TOL, может обеспечить превращение триптофана в индоксил, спонтанно окисляющийся до индиго (рис. 12.6).

Индиго, синий пигмент, который применяется для окрашивания хлопка и шерсти, был впервые выделен из растений; сейчас его получают путем химического синтеза. По оценкам,

вгод производится примерно 1,5·107 кг этого красителя на сумму около 200 млн. долл. Индиго окрашивают джинсовую ткань, и объем его продаж больше, чем любого другого красителя. Возможность получения индиго с помощью микроорганизмов позволяет разработать весьма эффективный и экономичный крупномасштабный микробиологический способ его производства, что дает возможность обойтись без использования таких токсичных веществ, как анилин, формальдегид и цианид, которые необходимы при химическом синтезе индиго. В настоящее время биотехнологи пытаются подобрать оптимальные условия выращивания больших количеств штамма Е. coli, способного к синтезу индиго. Среди подбираемых параметров температура, pH и количество триптофана

всреде, обеспечивающее максимальный выход

Рис. 12.6. Биосинтез индиго из триптофана, осуществляемый генетически модифицированной Е, coli. Триптофаназа - один из ферментов, продуцируемых E. coli. Ген нафталиндиоксигеназы, катализирующей реакцию А, происходит из плазмиды NAH, а ген ксилолоксидазы, катализирующей реакцию Б, — из плазмиды TOL. В трансформированных клетках E. coli индиго синтезируется либо по пути А, либо по пути Б, но не по ним обоим одновременно.

Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов

255

Рис. 12.7. Схематичное изображение биореактора, в котором можно было бы осуществлять синтез индиго с использованием рекомбинантных клеток Е. coli. Клетки иммобилизованы на частицах твердого матрикса. В реактор непрерывно подается субстрат (триптофан) и непрерывно выводится продукт (индиго). Скорость переноса вещества через реактор лимитируется скоростью превращения субстрата в продукт.

продукта. Эта система еще не готова для коммерческого использования, но уже ясно, что микробиологический процесс мог бы проходить в биореакторе, в котором рекомбинантные E. coli химически иммобилизованы на твердой матрице (например, на целлюлозе или силикагеле). Реактор мог бы работать в непрерывном режиме, с поступлением триптофана с одной его стороны и удалением индиго с другой (рис. 12.7).

Синтез аминокислот

Аминокислоты широко применяются в пищевой промышленности — в качестве усилителей вкуса и аромата, антиоксидантов и пищевых добавок; в сельском хозяйстве — в качестве кормовых добавок; в медицине — для терапии послеоперационных больных; в химической промышленности -в качестве исходных веществ при синтезе полимеров и производстве косметических средств (табл. 12.1). По оценкам, ежегодно в мире производится более 800 000 т аминокислот стоимостью более 5 млрд. долларов. При этом больше половины общего объема производства приходится на долю L-глутаминовой кислоты, которая используется для получения широко известного усилителя вкуса и аромата

–глутамата натрия.

Впромышленном масштабе аминокислоты получают в основном либо экстракцией из белковых гидролизатов, либо как продукты метаболизма двух неспорулирующих грамположительных почвенных бактерий, Corynebacterium или Brevibacterium spp. Обычно для повышения продуктивности этих микроорганизмов используется мутагенез с последующим отбором штаммов — сверхпродуцентов определенных аминокислот. Однако такой способ получения штаммов требует много времени, а эффективность его невелика. Альтернативный подход мог бы состоять в выделении и изменении специфических генов, кодирующих ключевые ферменты определенных биохимических реакций, на основании детальных биохимических данных об этих ферментах. Впрочем, такой генноинженерный подход может оказаться не столь простым. Так, в биосинтезе некоторых аминокислот могут участвовать несколько ферментов, которые активируются или ингибируются различными метаболитами, присутствующими в клетке. В такой ситуации трудно определить, какой фермент нужно модифицировать, чтобы увеличить выход конечного продукта. Кроме того, ученые пока не располагают исчерпывающими данными о биохимических свойствах указанных выше микроорганизмов, а соответствующие генноинженерные подходы находятся на стадии разработки. В частности, только создаются экспрессирующие векторы и методики трансформации для грамположительных организмов типа Corynebacterium и Brevibacterium spp.

Большинство плазмидных векторов с широким кругом хозяев реплицируются только в грамотрицательных микроорганизмах, поэтому необходимо создать векторы, специально предназначенные для экспрессии в Corynebacîenum и Brevibacterium spp. Это могли бы быть челночные векторы Е. coli—Corynebacterium. Ta их часть, которая происходит из плазмид E. coli, может со-

256 ГЛАВА 12

Таблица 12.1. Применение аминокислот

Аминокислота	Применение/Свойства
Аланин	Усилитель вкуса и аромата
Аргинин	Лечение заболеваний печей и
Аспарагин	Диуретик
Аспарагиновая	Усилитель вкуса и аромата;
кислота	синтез подсластителей
Валин	Растворы	для	внутривенных
	инъекций
Гистидин	Лечение язв; антиоксидант
Глицин	Синтез подсластителей
Глутамин	Лечение язв
Глутаминовая кислота	Усилитель вкуса и аромата
Изолейцин	Растворы	для	внутривенных
	инъекций
Лейцин	Растворы	для	внутривенных
	инъекций
Лизин	Кормовая	добавка;		пищевая
	добавка
Метионин	Кормовая добавка
Пролин	Растворы	для	внутривенных
	инъекций
Серин	Косметическая промышленность
Тирозин	Растворы	для	внутривенных
	инъекций: предшественник L-
	DOPA
Треонин	Кормовая добавка
Триптофан	Растворы	для	внутривенных
	инъекций; антиоксидант
Фенилаланин	Инфузии; синтез подсластителей
Цистеин	Производство		хлеба;	лечение
	бронхита; антиоксидант

держать гены устойчивости к тетрациклину, хлорамфениколу или канамицину. Поскольку и E. coli, и Corynebacterium spp. чувствительны к данным антибиотикам, эти гены могли бы служить селективными маркерами для обоих микроорганизмов.

Эффективный метод трансформации С. glutamicum, одного из видов Corynebacterium, часто используемых в такого рода экспериментах, до сих пор не разработан. Многие гены С. glutamicum неэффективно экспрессируются в Е. coli. Поэтому для систем отбора, основанных на экспрессии гена (например, при комплементации), клетки С, glutamicum должны быть трансформированы полным банком клонов. К сожалению, частота трансформации при введении ДНК в С glutamicum обычным способом или электропорацией очень низка. Ее можно существенно повысить, если для введения чужеродной ДНК использовать конъюгацию или удалить клеточные стенки трансформируемых клеток лизоцимом (использовать протопласты). Проникновение экзогенной плазмидной ДНК в протопласты облегчается в присутствии полиэтиленгликоля.

Получены первые положительные результаты в увеличении выхода незаменимой аминокислоты триптофана, синтезируемой С glutamicum, Для этого в клетки С. glutamicum дикого типа была введена вторая копия гена, кодирующего антранилатсинтазу, фермент, лимитирующий синтез триптофана (рис. 12.8). Ниже описан один из способов выделения этого гена.

1.Библиотеку хромосомной ДНК Brevibacterium flavum клонировали в челночном векторе С. glutamicum—E. coli и ввели в мутантный штамм С. glutamicum, не синтезирующий активной антранилатсинтазы.

2.Трансформантов отобрали по их способности расти в отсутствие антраниловой кислоты. Этим они отличались от мутантных нетрансформированных клеток.

3.Вектор, содержащий ген антранилатсинтазы, перенесли в штамм С. glutamicum дикого типа.

В табл. 12.2 представлены результаты определения количества триптофана, синтезированного мутантным штаммом С. glutamicum и штаммом дикого типа, которые содержали или не содержали вектор с клонированным геном антранилатсинтазы. Как видно из таблицы, клони-

Таблица 12.2. Синтез триптофана некоторыми

штаммами С. glutamicum при стандартных условиях роста1)

Штамм	Концентрация	триптофана,
	мг/мл

1) По данным Ozaki et al. U.S. parent 4,874,698T 1989.

Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов

257

Рис. 12.8. Упрощенная схема биосинтеза триптофана в клетках С glutamicum. Сплошные линии — биосинтетические реакции, штриховые — ингибирование по типу обратной связи. В качестве побочного продукта образуется индол, который превращается в триптофан под действием триптофансинтазы ß. DS

— 3-дезокси-D-арабиногептулозонат- 7-фосфатсинтаза. ANS — антранилатсинтаза, PRT - антранилатфосфорибозилтрансфераза.

рованный ген практически полностью восстанавливал способность мутантного штамма синтезировать триптофан. Однако эффект введения этого гена в штамм дикого типа был еще сильнее: уровень синтеза триптофана в этом случае увеличивался примерно до 130%, что связано с более эффективным использованием доступных предшественников. Еще более высокий уровень синтеза триптофана достигался при введении в клетки С. glutamicum модифицированных генов трех ключевых ферментов: 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазы, антранилатсинтазы и антранилатфосфорибозилтрансферазы. Гены, кодирующие эти ферменты, благодаря внесенным в них мутациям стали нечувствительны к ингибированию конечным продуктом (ингибирование по типу обратной связи).

В качестве альтернативы для синтеза аминокислот можно использовать E. coli. Этот микроорганизм хорошо изучен, а генноинженерные методы работы с ним более или менее детально разработаны.

Антибиотики

Со времени открытия пенициллина в конце 1920-х годов из различных микроорганизмов были выделены более 6000 антибиотиков, обладающих разной специфичностью и разным механизмом действия. Их широкое применение для лечения инфекционных заболеваний помогло сохранить миллионы жизней. Подавляющее большинство основных антибиотиков было выделено из гpaмположительной почвенной бактерии Strepfotnyces, хотя их продуцируют также грибы и другие грамположительные и грамотрицательные бактерии. Ежегодно во всем мире производится 100 000 т антибиотиков на сумму

258

ГЛАВА 12

примерно 5 млрд. долларов, в том числе более 100 млн. долларов приходится на долю антибиотиков, добавляемых в корм скоту в качестве добавок или ускорителей роста.

По оценкам, каждый год ученые обнаруживают от 100 до 200 новых антибиотиков, прежде всего в рамках обширных исследовательских программ по поиску среди тысяч различных микроорганизмов таких, которые синтезировали бы уникальные антибиотики. Получение и клинические испытания новых препаратов обходятся очень дорого, и в продажу поступают только те из них, которые имеют большую терапевтическую ценность и представляют экономический интерес. На их долю приходится 1—2% всех обнаруживаемых антибиотиков. Большой эффект здесь может дать технология рекомбинантных ДНК. Boпервых, с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Во-вторых, генноинженерные подходы могут использоваться для увеличения выхода антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства.

При создании рекомбинантных штаммов Streptomyces — основного микроорганизма, используемого для получения антибиотиков, – важно помнить, что трансформация и отбор трансформированных клеток не должны быть слишком сложными. Однако в отличие от Е. coli Streptomyces существуют не в виде изолированных клеток, а в виде протяженных мицелл, поэтому перед трансформацией необходимо разрушить клеточную стенку и высвободить отдельные протопласты (рис. 12.9). Без этого будет невозможно отличить трансформированные клетки от нетрансформированных, поскольку видимые колонии на твердой среде будут образовываться из группы клеток, а не из индивидуальной клетки; соответственно колонии, растущие в присутствии селективного антибиотика, будут представлять собой смесь трансформированных и нетрансформированных клеток. Проникновение плазмидной ДНК в протопласты Streptomyces облегчается в присутствии полиэтиленгликоля. После трансформации протопласты сначала высевают на твердую среду, чтобы образовалась

клеточная стенка, а затем для отбора трансформированных клеток переносят на селективную среду, обычно содержащую либо неомицин, либо тиострептон.

Рис. 12.9. Схема трансформации и отбора рекомбинантных штаммов Sireptvmycea. Tрансформированные клетки обозначены розовыми кружками, нетрансформированные

— зелеными. ПЭГ — полиэтиленгликоль.

Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов

259

Клонирование генов биосинтеза антибиотиков

Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 10—30 ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза -задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК. штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержащего функциональный экспрессируюшийся ген антибиотика [т. е. ген, восстанавливающий (комплементирующий) утраченную мутантным штаммом функцию], и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров.

Этот подход с успехом использовался для идентификации некоторых генов биосинтеза ундецилпродигиозина из Streptomyces coelicolor A3 (рис. 12.10), В этом случае комплементационный анализ основывается на сравнении цвета колоний: колонии микроорганизмов дикого типа имеют красный цвет, а колонии мутантных микроорганизмов

— кремовый. Таким образом, в результате комплементации образуется красная колония. Помимо комплементации, для идентификации генов биосинтеза антибиотиков могут

использоваться и более прямые подходы. Так, с

Рис. 12.10. Структурная формула ундецилпродигиозина.

помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их N- концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из Pénicillium chrysogenutn гена синтетазы изопенициллина N. Этот фермент катализирует окислительную конденсацию δ-(L-α-аминоадипил)-L-цистеинил-D-валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов (рис.

12.11 ).

Синтез новых антибиотиков

Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генноинженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в ходе которого был получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганизме двух немного различающихся путей биосинтеза антибиотика.

Одна из плазмид Streptomyces, рIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК S. coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетата антибиотика актинородина, представителя семейства изохроманхиноновых антибиотиков (рис. 12.12). Целую плазмиду и различные субклоны, несущие части 32,5 т.п.н.-фрагмента (например, рIJ2315), вводили либо в штамм АМ-7161 Streptomyces sp., синтезиурующий родственный антибиотик медермицин, либо в штамм В1140 или Tü22 S. violaceoruber, синтезирующие родственные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин.

Все указанные антибиотики являются кислотно-щелочными индикаторами, которые при-

260

ГЛАВА 12

Рис. 12.11. Биосинтез ленициллинов и цефалоспоринов в P. chrysogenum. Синтетаза изопенициллина N катализирует синтез из δ-(L-α-аминоалилил)- L-цистеинил-D-валина изопенициллина N — предшественника пенициллина G, пенициллина N и цефалоспорина С.

дают растущей культуре характерный цвет, зависящий от pH среды (табл. 12.3). В свою очередь pH (и цвет) среды зависят от того, какое соединение синтезируется. Мутанты родительского штамма 5. coelicolor, не способные синтезировать актинородин, бесцветные. Появление окраски после трансформации штамма АМ-7161 Streptomyces sp. либо штаммов В1140 или Tü22 S. violaсеоruber плазмидой, несущей все или несколько генов, кодирующих ферменты биосинтеза актинородина, свидетельствует о синтезе нового антибиотика (рис. 12.12, табл. 12.3), Трансформанты штамма АМ-7161 Streptomyces sp. и штамма В1140 S. violaceoruber, содержащие плазмиду p[J2303, синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и хромосомной ДНК. Однако при трансформации штамма Tü22 5. violaceoruber плазмидой pIJ2303 наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик — Дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Sireptomuces sp. плазмидой pIJ2315 синтезируется еще один новый антибиотик — медерродин А.

В структурном отношении эти новые антибиотики мало отличаются от актинородина, медермицина, гранатицина и гидрогранатицина и, вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтеза служит субстратом для фермента другого пути. Когда будут детально изучены биохимические свойства различных путей биосинтеза антибиотиков, появится возможность создавать новые уникальные высокоспецифичные антибиотики, манипулируя генами, которые кодируют соответствующие ферменты.

Разработка новых методов получения поликетидных антибиотиков

Термин «поликетидные» относится к классу антибиотиков, которые образуются в результате