Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

Биодеградация и утилизация биомассы

301

этилпропионата, 2-бутанола, изоамилацетата, изоамилонового спирта и изомасляной кислоты. С помощью такой генетической модификации можно стабилизировать процесс ферментации и создать такие штаммы дрожжей, которые будут производить вина с определенными свойствами.

Исследовалась также возможность использования целлюлазпри промышленной биопереработке бумажных отходов в этанол. Для этого отходы частично расщепляли целлюлазами при 45 °С, а затем, не удаляя целлюлаз, проводили ферментацию высвободившейся глюкозы с помощью S. cerevisiae при 37 °С. Основываясь на полученных результатах, рассчитали, что этот подход позволит получить 400 л этанола из 1 т бумажных отходов. Если все 100 млн. т бумажных отходов, ежегодно образующихся в Северной Америке, превратить в этанол и использовать его в качестве топлива, можно сэкономить примерно 16% бензина.

Белок одноклеточных организмов

Белок одноклеточных организмов (БОО) — термин, принятый для обозначения белковых продуктов, синтезируемых монокультурой микробных клеток и использующихся в качестве пищевых добавок или корма для скота. Вопрос об использовании микробной биомассы в качестве источника белка рассматривается вполне серьезно. Это связано не только с дефицитом продовольствия в общемировом масштабе, но и с тем, что содержание белка в большинстве микроорганизмов весьма велико: на его долю приходится примерно 60-80% сухой массы клетки. Кроме того, благодаря высокому содержанию метионина, лизина, витаминов и важных минералов БОО обладает более высокой пищевой ценностью, чем некоторые виды пищи растительного и животного происхождения. Но широкое применение БОО сдерживается по ряду причин,

•Высокое содержание нуклеиновых кислот, что может представлять опасность при некоторых патологических состояниях.

•Возможное присутствие в продуктах токсичных веществ, адсорбированных из субстрата

(например, тяжелых металлов) или вырабатываемых самим микроорганизмом (например, микотоксинов), и связанная с этим необходимость проведения дорогостоящих контрольных анализов.

•Низкая скорость разрушения микробных клеток в пищеварительном тракте, что может вызвать расстройство пищеварения или аллергические реакции.

•Более высокая стоимость БОО по сравнению с другими белковыми продуктами, например

сбелками сои.

Для получения БОО использовали многие микроорганизмы (бактерии, дрожжи, грибы, водоросли, актиномицеты) и различные субстраты (табл. 13.9). Впервые крупномасштабное производство БОО было налажено в Германии во время Первой мировой войны: на патоке в качестве источника углерода и солях аммония в качестве источника азота выращивали S. cerevisiae и добавляли их в супы и колбасные изделия для повышения содержания белка.

До 1973 г. нефть была довольно дешевым продуктом, а ее запасы считались практически неограниченными. В связи с этим сразу несколько крупных нефтяных компаний разработали проект по производству БОО из нефти и продуктов ее переработки. Но цены на нефть росли, и интерес к этим проектам пропал. В 1970-х гг. компания Imperial Chemical Industries (ICI) разработала непрерывный процесс ферментации метанола с помощью бактерии Methylophilus methylotrophus для коммерческого производства белка прутина. Эта бактерия использует метан (точнее, метанол) в качестве ос-

Таблица 13.9. Субстраты и микроорганизмы, использующиеся при производстве БОО

Субстрат	Микроорганизм	Микроорганизм
	Spirulina maxima
Диоксид углерода		Цианобактерии
Сыворотка (лактоза) Ktuyveromyces		Дрожжи
	fragils
Алканы нефти	Candida	Дрожжи
	lipolytica
Целлюлозные	Chaetomium	Грибы
отходы	cellulolyticum
Метан (метанол)	Methylophilus	Бактерии
	methylotrophus

302

ГЛАВА 13

новного субстрата. В 1979 г. был построен завод с самым большим в мире работающим в непрерывном режиме эрлифтным ферментером, способным производить до 50 000 т БОО в год. Но несмотря на инвестиции ICI, составившие более 200 млн. долл., и серьезные инженерные и биотехнологические успехи, к 1987 г. на этой установке было произведено лишь незначительное количество БОО, поскольку его получение с помощью M. methylntrophus; оказалось невыгодным.

В последнее время интерес к БОО появился снова; теперь это связано с утилизацией различных отходов (например, целлюлозы и сыворотки), В одних случаях предполагается использовать природные микроорганизмы, и других - микроорганизмы, созданные методами генной инженерии. Но так или иначе, перспективы развития производства БОО будут определяться не природой микроорганизмов, а экономическими соображениями. Возможно, рентабельность производства удастся повысить, если БОО будут получать из побочных продуктов утилизации отходов. Для того чтобы разработать экономичный процесс производства БОО из отходов, необходимо изучить кинетику роста, метаболизм, возможности генетического манипулирования и безопасность многих микроорганизмов, а также вкусовые качества синтезируемых ими продуктов.

Разработан новый подход, с помощью которого можно будет обеспечивать крупный рогатый скот белком, обогащенным незаменимыми аминокислотами. Простое добавление белкок R корм — дорогостоящий и не особенно эффективный способ, поскольку белки и аминокислоты разрушаются бактериями рубиа еще до того, как животное успеет их использовать. Кроме того, основное количество белка они получают не с кормом; его поставляют присутствующие в рубце микроорганизмы. Рацион животных можно обогатить, если направленно модифицировать эти бактерии. Для этого сначала был синтезирован белок с высоким содержанием остатков метионина, треонина, лизина и лейцина. Он состоял из 100 аминокислот, 57 из которых были незаменимыми, и имел стабильную α-спиральную конфигурацию. Затем с помощью 14 частично перекрывающихся олигонуклеотидов синтезировали его ген и сшили его с геном белка, связывающего мальтозу; полученный гибридный ген экспрессировали в E. coli под транскрипционным контролем tac-промотора. На долю гибридного белка приходилось примерно 12% суммарного внутриклеточного белка. Теперь нужно выяснить, будет ли этот белок синтезироваться в достаточном количестве присутствующими в рубце бактериями. Если этот подход окажется успешным, то он станет основой уникальной системы непрерывного обеспечения крупного рогатого скота незаменимыми аминокислотами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биодеградация — это процесс разрушения микроорганизмами веществ, загрязняющих окружающую среду. Многие бактерии рода Pseudomonas несут плазмиды, кодирующие ферменты, которые катализируют расщепление ароматических и галогенсодержащих ограничкских соединений. В большинстве случаев одна плазмида содержит гены ферментов одного специфичного катаболического пути. Объединяя плазмиды разных штаммов Pseudomonas в одном хозяине, можно создать организм, способный к деградации нескольких соединений. Кроме того, с помощью генетических манипуляций можно расширить спектр субстратов, разрушаемых с помощью определенного ферментативного пути.

Под биомассой здесь понимается вся совокупность веществ и материалов, побочных продуктов пищевой и перерабатывающей промышленности, которая может служить сырьем для получения ценных продуктов. Производство этанола или фруктозы из молотого зерна происходит в несколько ферментативных стадий. Участвующие в этих процессах ферменты часто используются однократно. Чтобы повысить эффективность ферментативных реакций и снизить стоимость процессов, исследователи занимаются клонированием и исследованием свойств бактериальных генов, кодирующих термостабильные, обладающие высокой каталитической активностью и устойчивые к действию спирта ферменты,

Для повышения эффективности промышленного производства этанола в бактерию

Биодеградация и утилизация биомассы

303

Zymomonas mobilis были введены гены, благодаря экспрессии которых она могла использовать в качестве источника углерода широкий спектр соединений. Предприняты первые шаги на пути создания штаммов Lactobacillus plantarum, способных эффективно расщеплять крахмал, содержащийся в большом количестве в такой важной сельскохозяйственной культуре, как люцерна.

При переработке растительного материала часто образуется большое количество лигноцеллюлозных отходов, которые раньше не находили применения. Сейсас лигноцеллюлоза служит сырьем для получения углеродсодержащих соединений, в первую очередь глюкозы, которые можно использовать в других процессах. Лигноцеллюлоза — это комплекс из лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы, не подверженный действию ферментов без предварительной обработки. Проводимые в последнее время исследования были направлены в основном на изучение механизма расщепления целлюлозы с образованием глюкозы. Клонированы и охарактеризованы гены эндоглюканаз, экзоглюканаз и ß-глюкозидаз многих микроорганизмов, но пока не определен набор ферментов, осуществляющих масштабное эффективное расщепление целлюлозы in vitro.

Некоторые виды биомассы (например, сыворотка, целлюлозные отходы) и продукты переработки нефти могут служить субстратом при культивировании микроорганизмов. Предполагалось, что эти чистые культуры, а также их продукты (так называемый белок одноклеточных организмов, БОО) можно будет использовать в качестве пищевых добавок или корма для скота. К сожалению, вследствие дороговизны получаемых проуктов, их невысоких вкусовых качеств, а иногда и токсичности производство БОО оказалось экономически нецелесообразным. Однако есть надежда, что с помощью генетических манипуляций все-таки удастся создать систему, позволяющую получать дешевые биологические добавки на основе БОО.

ЛИТЕРАТУРА

Barnett С. С. 1991. Cloning and amplification of the

gene encoding an extracellular ß-glucosidase from Trichoderma reesei: evidence for improved rates of saccharification of cellulosic substrates. Bio/Technology 9: 562-567.

Beauregard M., C. Dupont, R. M. Teather, M. A. Ilefford. 1995. Design, expression, and initial characterization of MB1, a de novo protein enriched in essential amino acids. Bio/Techno-logy 13: 974981.

Béguin P. 1990, Molecular biology of cellulose degradation. Annu. Rev. Microbiol. 44: 219—248. Brown D. E. 1983. Lignocellulose hydrolysis. Philos. Trans. R. Soc. Land. £300: 305-322.

Buchholz S. E., M. M. Dooley, D. E. Eveleigh. 1987. Zymomonas—л\\ alcoholic enigma. Trends Biotechnol. 5: 199-204.

Buchholz S. E., D. E. Eveleigh. 1990. Genetic modification of Zymomonas mobilis. Biotechnol. Adv. 8: 547-581.

Chakrabarty A. M. March 1981. Microorganisms having multiple compatible dcgradativc energygenerating plasmids and preparation thereof. U.S. patent 4,259.444.

Cole G. E., P. C. McCabe, D. Intow, D. H. Gelfand, A. Ben-Bassat, M. A. Innis. 1988. Stable expression of AspergHlus awamori glucoamylase in distiller's yeast. Bio/Technology 6: 417-421.

Cork D. J., J. P. Krueger. 1991. Microbial transformation of herbicides and pesticides. Adv. Appl. Microbiot. 36: 1—66.

Dekker K., A. Sugiura, H. Vamagata, K. Sakaguchi, S. Udaka. 1992. Efficient production of ther-jvioftubi·:: Ί/ΐίτα··:^ 'fxrHH'/.'/ii'i'y xylose isomerase in Escherichia coli and Bacillus brevis. Appl. Microbiol. Biotechnol.36: 727-732.

Eveleigh D. E. 1987. Cellulase: a perspective. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В 321: 435-447.

Fitzsimons Α., P. Hols, J. Jore, R. J. Leer, M. ü'Connell, J. Delcour. 1994. Development of an amylolytic Lactobacillus plantarum silage strain expressing the Lactobacillus amylovorus oc-amylase gene. Appl. Environ. Microbiol. 60: 3529-3535.

Ghosal D., I.-S. You, D. K. Chattcrjee, A. M. Chakrabarty. 1985. Microbial degradation of halogenated compounds. Science 228:135—142.

Click B. R., J. J. Pasternak. Î9S9. Isolation, characterization and manipulation of cellulase genes.

BiotechnoL Adv. 7: 361-386.

Innis Μ. Α., M. J. Holland, P. C. McCabe, G. E. Cole, V. P. Wittman, R. Tal, K. W. K. Watt,

304

ГЛАВА 13

D. H. Gelfand, J. P. Holland, J. H. Meade. 1985. Expression, glycosylation and secretion of an Aspergillus glucoamylase by Saccharomyces cere-visiae. Science 228: 21-26.

Kallio P-, A. Palva, I. Palva. 1987. Enhancement of α-amylase production by integrating and amplifying the α-amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens in the genome of Bacillus subtUis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 27: 64-71.

Kennedy J. F., V. M. Cabalda, С. A. White. 1988. Enzymic starch utilization and genetic engineering. Trends Biotechnol. 6: 184—189.

Knowles J., P. Lehtovaara, T. TeerL 1987. Cellulase families and their genes. Trends Biotechnol. 5: 255-261.

Kolenc R. J., W. E. Inniss, B. R. Click, C. W. Robinson, C. I. Mayfield. 1988. Transfer and expression of mesophilic plasmid-mediated dcgradative capacity in a psychrotrophic bacterium.

Appl. Environ. Microbiol. 54: 638—641.

Kumar V., S. Riimakrishiian, T. T. Teeri, J. К. С Knowles,

B.S. Hartley. 1992. Saccharomyces cerevisiae cells secreting an Aspergillus tiigcr β galactosidase grow on whey permeate. Bio/Technotogy 10: 82-85.

Lamed R., J. Nainiark, E. Morgenstern, E. A. Bayer. 1987. Speciali/cd cell surface structures in cellu-lolytic bacteria. J. Bacteriol. 169: 3792-3800.

Lynd L. R., J. H. Cushman, R. J. Nichols,

C.E. Wyman. 1991. Fuel etlianol from cellulosic biomass. Science 251: 1318-1323.

Meng M., С. Lee, M. Bagdasarian, J. G. /cikus. 1991. Switching Substrate preference of thermophilic xylose isomerase from D-xylose to D-glucose by redesigning the substrate binding pocket. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 4015-4019.

Pérez-Gonzàles J. A., R. Gonzales, A. Querol, J. Sentira, D. Ramon. 1993. Construction of a recombinant wine yeast strain expressing ß-( 1,4)-endoglucanase and its use in microvinifica-tion processes. Appl. Environ. Microbiol. 59: 2801-2806.

Quax W. J., N. T. Mrabet, R. G. M. Luiten, P. W. Schuurhuizen, P. Stanssens, I. Lasters. 1991. Enhancing the thermostabiligy of glucose isomerase by protein engineering. Bio/Technology 9: 7'38-742.

Ramos J. L·, A. Wasserfallen, K. Rose, K. N. Timmis. 1987. Redesigning metabolic routes: manipulation of TOL plasmid pathway for catabo-lism of alkyl-benzoates. Science 235: 593-596.

Suyama A., R. Iwakiri, N. Kimura, A. Nishi, K. Nakamura, K. Furukawa. 1996. Engineering hybrid pseudomonads capable of utilizing a wide range of aromatic hydrocarbons and of efficient degradation of trichloroethylene. J. Bacteriol. 178: 4039-4046.

Timmis K. N., R. J. Steffan, R. Unterman. 1994. Designing microorganisms for the treatment of toxic wastes. Anna. Rev. Microbiol. 48: 525-557.

Verdoes J. C., A. D. van Diepeningen, P. J. Punt, A. J. M. Debets, A. H. Stouthamer, C. A. M. J. J. van den Hondcl. 1994. Evaluation of molecular arid genetic approaches to generate glucoamylase overproducing strains of Aspergillus niger. J. Biotechnol. ЪЬ\ 165-175.

Wayman M., S. (Сhen, K. Doan. 1992. Bioconversion of waste paper to ethanol. Process Biochem. 27: 239-245.

Windass J. D.f M. J. Worsey, E. M. Pioli, D. Ptoli, P. T. Barth, K. T. Atherton, E. C. Dart, D. Byrom, K. Powell, P. J. Senior. 1980. Improved conversion of methanol to single cell protein by Methyiophilus methylotrophus. Naiure2S7: 396-401.

Winter R. В., К.-М. Yen, B. D. Ensley. 1989. Efficient degradation of trichloroethylene by a recombinant Escherichia coli. Bio/Technology 7: 282-285.

Witholt В., M.-J. de Smet, J. Kingnta, J. B. van Beilen, M. Kok, R. G. Lageveen, G. Eggink.

1990. Bioconversions of aliphatic compounds by Pseudomonas oleovorans in multiphase bioreactors: background and economic potential. Trends Eiotechiwl 8:46-52.

Wong W. K. R., C. Curry, R. S. Parekh, S. R. Parekh, M. Wayman, R. W. Davies, D. G. Kilburn, N. Skipper. 1 'JXS. Wood hydrolysis by Cellulomonas fumi endoglucanase and exoglucanase coexpressed as secreted enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Bio/Technology 6: 713-719.

7harig M., C. Eddy, K. Deanda, M. Finkelstein, S. Picataggio. 1995. Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilts. Science 267: 240—243.

Биодеградация и утилизация биомассы

305

Zylstra G. J., L. P. Wackett, D. T. Gibson. 1989. Trichloroethylene degradation by Escherichia со/г containing the cloned Pseydomonasputida FI toluene dioxygenase genes. Appi. Environ. Microbiol. 55: 3162-3166.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Как следует модифицировать P. putida, чтобы получился штамм, эффективно разрушающий трихлорэтилен?

2.Опишите процедуру клонирования целлюлазных генов грибов.

3.Как используются α-амилаза и глюкоамилаза в промышленном производстве этанола? Какие манипуляции с кодирующими эти ферменты генами следует провести, чтобы повысить эффективность процесса?

4.Что представляет собой фермент глюкозоизомераза? В чем состоит ее ценность? Как

изачем можно модифицировать кодирующий ее ген?

5.Опишите достоинства и недостатки использования Zymomonas mobilîs вместо Saccharomyces cerevisiae при производстве этанола. Как повысить эффективность промышленного использования Z. mobilis?

6.Как с помощью генноинженерных методов модифицировать Z. mobilis, чтобы можно было использовать этот микроорганизм для производства этанола из ксилозы?

7.Взяв три штамма Pseudomonas., один из которых использует фенол в качестве единственного источника углерода при 0 °С, второй расщепляет антрацен с образованием катехола при 35 °С, а третий расщепляет n-толуол с образованием протокатехоата при 35 °С, предложите стратегию создания штамма, который сможет использовать в качестве единственного источника углерода фенол, антрацен или n-толуол при О °С.

8.Как модифицировать штамм Pseudotnonas, несущий плазмиду pWWO и не способный расщеплять 4-этилбензоат, чтобы он мог утилизировать это соединение?

9.Предложите стратегии выделения прокариотических эндоглюканазных и ß- глюкозидазных генов.

10.Что такое «супербацилла»?

11.Как повысить эффективность образования силоса, проводя манипуляции с

Lactobacillus plantarum?

12.Как следует модифицировать бактерии рубца, чтобы они обеспечивали крупный рогатый скот незаменимыми аминокислотами?

ГЛАВА 14.

Бактерии, стимулирующие рост растений

Скорость роста и урожайность растений в естественных условиях зависят от их генотипа, доступности питательных веществ, наличия в почве полезных микроорганизмов и отсутствия патогенных (так называемых фитопатогенов, от phyto — растение). Одни виды полезных природных почвенных бактерий и грибов оказывают прямое действие, другие опосредованное. Первые поставляют растениям соединения, стимулирующие их рост, вторые подавляют размножение патогенных почвенных микроорганизмов, предотвращая их негативное влияние на растение.

К основным механизмам стимуляции роста растений микроорганизмами «прямого действия» относятся: 1) фиксация атмосферного азота, который затем используется растением; 2) образование легко усваиваемых форм железа и фосфора и/или поглощение из почвы и доставка этих полезных минеральных веществ в растения; 3) синтез фитогормонов, вызывающих пролиферацию растительных клеток. Опосредованная стимуляция роста растения каким-либо штаммом полезного микроорганизма проявляется через предотвращение роста фитопатогенного почвенного микроорганизма, который MOГ бы отрицательно влиять на нормальный рост и развитие растения. Такое действие называется антибиозом и может заключаться либо в истощении полезным микроорганизмом лимитирующего субстрата, либо в синтезе и секреции соединения, препятствующего росту фитопатогена.

Последние генетические эксперименты по созданию штаммов микроорганизмов, способных более эффективно стимулировать рост растений, были направлены в основном на решение следующих четырех проблем.

•Молекулярные механизмы фиксации азота. Цель всех исследований состояла в том, чтобы оценить возможности повышения уровня фиксации азота микроорганизмами и, следовательно, снизить количество вносимых в почву химических удобрений.

•Образование корневых клубеньков симбиотическими бактериями. Целью этих исследований было создание рекомбинантных бактерий, способных конкурировать с природными симбиотическими бактериями.

•Микробиологический синтез веществ, хелатирующих железо (сидерофоров). Есть надежда, что удастся получить штаммы микроорганизмов, подавляющие рост фитопатогенов.

•Микробиологический синтез фитогормонов. Эти исследования проводились для того, чтобы создать штаммы бактерий, синтезирующие и секретирующие определенные количества фитогормонов, которые ускоряли бы рост растений.

Исследования в этой области проводятся главным образом на бактериях, а не на грибах. Отчасти это обусловлено тем, что полезные грибы не удается вырастить в культуре, поэтому

сними трудно работать в лабораторных условиях, а кроме того, невозможно получить эти организмы в количестве, достаточном для инокуляции.

Фиксация азота

Азот (N2) — газ, на долю которого приходится примерно 80% (по объему) воздуха, которым мы дышим. Растения или животные не могут использовать его непосредственно для синтеза не-

Бактерии, стимулирующие рост растений

307

обходимых им биологических азотсодержащих соединений типа аминокислот и нуклеотидов; предварительно азот должен быть включен в состав аммиака (фиксирован). Это требует больших энергетических затрат, поскольку тройная связь в молекуле N2 (N = N), которую необходимо предварительно разорвать, чрезвычайно прочная. Энергия для биологической фиксации азота высвобождается при гидролизе больших количеств аденозинтрифосфата (АТР). Для химического (промышленного) превращения N2 в аммиак используют высокие температуру и давление.

Для удовлетворения потребностей пищевой промышленности в сельскохозяйственной продукции ежегодно требуется более 100 млн. т связанного азота. Примерно половину этого количества составляют синтетические (химически синтезированные) удобрения, а большую часть второй половины растения получают от азотфиксирующих (диазотрофных) бактерий типа Rhizobium, Frankia, Azospirillum, Azotobacfer и цианобактерий. Ни один из эукариотических организмов не способен связывать азот.

Благодаря применению химических удобрений удалось значительно повысить урожайность сельскохозяйственных культур, однако их продолжительное использование приводит к загрязнению почвы и истощению запасов в ней питательных веществ. К тому же химические удобрения становятся все более дорогими. Все это стимулировало поиск альтернативных источников связанного азота, в частности создание штаммов диазотрофных микроорганизмов, которые могли бы служить «бактериальными удобрениями».

Способностью к фиксации азота обладают самые разные бактерии, и многие из них в принципе могут использоваться как удобрения. Однако до тех пор, пока не будет показано, что бактериальные удобрения столь же эффективны, как и химические, вряд ли удастся преодолеть консерватизм производителей сельскохозяйственной продукции и изменить используемые в настоящее время подходы. Например, вторая по экономической значимости и по занимаемым площадям сельскохозяйственная культура в США — соя — формирует симбиотические отношения с бактерией Bradyrhizobium japonicum. B результате такого симбиоза бактерии обеспечивают растение связанным азотом, а сами получают от него легко усваиваемые формы углерода, образующиеся при фотосинтезе. После инокуляции растений некоторыми штаммами В. japonicum конечный выход растительной биомассы может возрасти на 25—50% и никаких добавок химически связанного азота больше не потребуется. Примерно 50% сои выращивается в нескольких регионах США, при этом везде используется в общем сходная технология. Но лишь небольшую часть этой культуры в настоящее время обрабатывают В. japonicum. Фермеры до сих пор полагаются на природные штаммы В. japonicum и химические удобрения.

Репутация бактериальных удобрений весьма сомнительна. В 1950-х годах в СССР

более 10 млн. га сельскохозяйственных угодий обрабатывались смесью диазотрофных бактерий, состоящей в основном из Azotobacter chroococcum и Bacillus megaterium. При этом примерно в 60% случаев урожайность различных зерновых повысилась на 10— 20%. Однако эти полевые испытания оказались некорректными и невоспроизводимыми; многие исследователи выразили сомнения в правильности полученных результатов, и использование бактериальных инокулятов в качестве удобрений не получило развития. Однако проблемы экономического характера, необходимость предотвращения загрязнения окружающей среды, появление новых технологий привели к тому, что ученые вновь обратились к изучению возможности использования бактериальных удобрений.

Микроорганизмы, которые применяются в настоящее время в сельском хозяйстве, принадлежат в основном к двум родам: Rhizobium и Bradyrhizobîum. Это грамотрицательные палочкообразные жгутиковые бактерии, находящиеся в симбиозе с бобовыми. Каждый вид Rhizobium и Bradyrhizobîum специфичен в отношении лишь небольшого числа видов растений и не взаимодействует с растениями, не являющимися его природными хозяевами (табл. 14.1).

На определенной стадии жизненного цикла Rhizobium проникает в клетки корня растения и инициирует комплекс изменений, приводящих к формированию корневого клубенька. Бактерии внутри корневого клубенька быстро проли-

308

ГЛАВА 14

Таблица 14, 1, Специфичность видов Rhizobium и Bradyrhizobium в отношении разных растений

Бактерия	Растение-хозяин
Bradyrhizobium japonicum	Соя
Rhizobium meliloti	Люцерна
Rhizobium leguminosarum bv, trifolii	Клевер
Rhizobium leguminosarum bv. viciae	Горох, фасоль
Rhizobium leguminosarum	Фасоль обыкновенная,
bv, phaseoli	фасоль золотистая
Rhizobium loti	Лотос
Rhizpbium huakuii	Astragalus sinicus
Rhizobium ciceri	Турецкий горох
Rhizobium tropici	Leucaena spp., Macroptilium spp.
Rhizobium galegne	Galega officinalis. G. orientalis
Rhizobium fredii	Соя
Rhizobium sp. штамм NGR 234	Тропические бобовые
Rhizobium elti	Фасоль обыкновенная, фасоль золотистая
Bradyrhizobium elkanii	Соя

ферируют и находятся в форме, не имеющей клеточной стенки. Клубеньковые бактерии связывают атмосферный азот с помощью фермента нитрогеназы. Структурные и биохимические взаимодействия между симбионтами - Rhizobium и растением-хозяином — весьма сложны и взаимовыгодны. Внутри клубенька нитрогеназа защищена от токсического действия атмосферного кислорода двумя способами. Во-первых, кислород практически не проникает в клубенек. Во-вторых, содержание кислорода внутри клубенька регулируется белком леггемоглобином. Гемовый компонент этого кислородсвязываюшего белка синтезируется бактерией, а глобиновая часть молекулы кодируется геномом растения. Растение обеспечивает бактерии необходимыми для роста связанными формами углерода, образующимися при фотосинтезе, а растение извлекает выгоду из этих симбиотических отношений, получая от бактерии связанный азот.

Нитрогеназа

Интерес к диазатрофам как к биологическим удобрениям возродился после того, как были разработаны методы выделения и модификации генов, и это стимулировало изучение биохимических и молекулярно-биологических механизмов фиксации азота. Ученые надеялись, что благодаря этим исследованиям удастся создать более эффективные азотфиксирующие микроорганизмы, способствующие повышению урожайности сельскохозяйственных культур, а некоторые исследователи лаже предполагали ввести бактериальные гены фиксации азота непосредственно в растения, чтобы такие растения могли сами фиксировать азот. И хотя эти чересчур смелые планы не удалось осуществить, процесс фиксации азота был детально изучен, так что возможность генноинженерного усовершенствования некоторых диазотрофов стала более реальной.

Компоненты

Все известные нитрогеназы содержат два кисло-родчувствительных компонента: I и 11. Компонент 1 — это комплекс из двух а-субъединиц (массой примерно 50 000 Да каждая), двух β-субъединиц (примерно 60 000 Да каждая), 24 молекул железа, двух молекул молибдена и железо-молибденового кофактора, обозначаемого FeMoCo (рис. 14.1). Компонент II состоит из двух α-субъединиц (примерно 32 000 Да каждая) и из неизвестного числа молекул железа, причем его α-субьединицы не аналогичны таковым в компоненте 1. Для фиксации азота необходимы оба компонента, комплекс магния и ATP, a также источник восстановительных эквивалентов:

Рис. 14.1. Предполагаемая структура железомолибденового кофактора, связанного с молекулой азота (N2).

Бактерии, стимулирующие рост растений

309

Помимо фиксации азота, нитрогеназа катализирует также восстановление

газообразного ацетилена до этилена:
Н-С≡С-Н + 2Н+ --> Н2=С=С=Н2.	(2)

Определяя с помощью газовой хроматографии количество синтезированного этилена, можно оценивать активность нитрогеназы. Определения можно проводить на целых клетках в растворе (рис. 14.2), на бактериях, ассо-

циированных с корнями растений, на грубых экстрактах клеток или на высокоочищенных препаратах фермента. Компонент I катализирует собственно восстановление N2, a компонент 11 служит донором электронов. Оба они чрезвычайно чувствительны к кислороду и при слишком высоких его концентрациях быстро и необратимо инактивируются. Функционирование нитрогеназы зависит также от 15—20 вспомогательных белков. Роль некоторых из них состоит в передаче электронов

Рис. 14.2. Определение активности нитрогеназы по восстановлению ацетилена до этилена. А, Бактерии (в культуре или ассоциированные с корнями растения), синтезирующие нитрогеназу, либо препарат очищенного фермента (не показано) помещают в герметичную емкость в атмосферу ацетилена. Б. Из емкости периодически отбирают пробы и методом газовой хроматографии измеряют количество ацетилена и этилена. Активность нитрогеназы пропорциональна количеству образовавшегося этилена.

310

ГЛАВА 14

компоненту II, а также в биосинтезе железомолибденового кофактора.

Генная инженерия кластера генов нитрогеназы

Фиксация азота — очень сложный процесс, требующий согласованного действия множества разных белков. Поэтому вряд ли можно было ожидать, что вся генетическая информация, необходимая для фиксации азота, будет содержаться в каком-то одном фрагменте ДНК и что этот фрагмент удастся вычленить из генома диазотрофного микроорганизма и перенести в недиазотрофный организм. Следует еще учесть, что физиологические условия в организме реципиента должны быть подходящими для функционирования активной нитрогеназы. Более приемлемый способ выделения генов азотфиксации (nif-генов) состоял в том, чтобы идентифицировать и охарактеризовать те клоны библиотеки ДНК дикого типа, которые восстанавливают способность различных мутантов данного микроорганизма фиксировать азот. Такой метод называется генетической комплементацией.

Первые nif-гены, идентифицированные методом комплементации, были выделены из банка клонов диазотрофиой бактерии Klebsiella pneumoniae. Эта хорошо изученная энтеробакте-рия, которая обнаруживается в почве и воде, а также в кишечнике человека. Схема выделения состоит в следующем (рис. 14.3).

1.Клетки К. pneumoniae обрабатывают такой дозой мутагена, чтобы выживаемость составила примерно 0,1—1,0%. Некоторые из мутантных клеток, способные расти на

минимальной среде, содержащей источник связанного азота типа NH4C1, но не в отсутствие связанного азота, вероятно, несут мутацию в nif-гене; их обозначают Nif --.

2.Используя экспрессирующие плазмидные векторы с широким кругом хозяев, создают банк клонов хромосомной ДНК К. pneumoniae дикого типа (Nif+) и поддерживают его в Е. coli.

3.Проводят конъюгацию Nif–-клеток К. pneumoniae с клетками E. coli, несущими банк клонов в плазмидных векторах.

4.Трансформированные клетки К. pneumoniae, приобретшие фенотип Nif+, отбирают,

высевая их на минимальную среду, не содержащую источника связанного азота. В этих условиях растут только Nif–-клетки К. pneumoniae с плазмидой, кодирующей белок, который отсутствует или не функционирует в Nif–-мутанте.

Фрагмент ДНК в плазмиде, комплементирующий хромосомную мутацию Nif–, содержит nif-ген, который можно детально охарактеризовать и использовать для выделения других nif- генов.

Для выделения других генов, участвующих в фиксации азота, применяли два подхода.

Во-первых, использовали банк клонов К. pneumoniae для комплементации независимо возникающих Nif–-мутантов, увеличивая тем самым вероятность того, что в каждом случае будет выделен другой nif-ген. Во-вторых, выделенные nif-гены использовали в качестве гибридизационных зондов для скрининга банка клонов хримосомной ДНК К. pneumoniae, несущих большие вставки (от 7 до Шт. п. н.), исходя из того, что у прокариот гены одного пути биосинтеза обычно образуют кластеры.

В результате всесторонних исследований был идентифицирован и охарактеризован весь набор nif-генов К. pneumoniae. Эти гены организованы в один кластер длиной примерно 24 т. п. н. (рис. 14.4), который содержит семь отдельных оперонов, колирующих в общей сложности 20 разных белков (табл. 14.2). Для того чтобы образовалась активная нитрогеназа, все nif-гены

Таблица 14.2. Гены К. pneumonias, участвующие

вфиксации азота, и кодируемые ими белки (или

функции)

nif- Ген Белок (функция)