Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

Микробные инсектициды

341

Рис. 15.6.

Получение рекомбинантного штамма

P.fluorescens, в

хромосомную ДН К которого встроен ген токсина В. thuringiensis.

Ген встраивают в не способный к вырезанию транспозон Tn5, локализованный в плазмиде. Такую конструкцию вводят в

штамм P.ßuorescens,

содержащий в своей хромосомной ДНК транспозон Тn5 дикого типа. В результате гомологичной рекомбинации не способный к вырезанию транспозон Тn5, несущий ген токсина В. thuringiensis, оказывается встроенным в хромосому

P. fluorescens.

5. Осуществили гомологичную рекомбинацию с помощью двойного кроссинговера между не способным к транспозиции Тn5-элементом, несущим ген токсина, и «плазмидным» транспозоном Тn5 дикого типа, интегрированным в хромосому, В результате интеграции измененный транспозон Тn5 с геном токсина оказался встроенным в хромосомную ДНК, а транспозон Тn5 дикого типа был элиминирован.

В таком виде ген токсина вряд ли утратится при крупномасштабном выращивании рекомбинантных микроорганизмов в лабораторных условиях или после их переноса в окружающую среду. Кроме того, вероятность передачи такого гена другим микроорганизмам в окружающей среде очень мала. Как показали предварительные исследования, рекомбинантный штамм P. fluorescens токсичен для личинок бражника, Теперь планируется проверить способность этого рекомбинантного микроорганизма минимизировать повреждения корней насекомыми-вредителями в оранжереях и в полевых условиях.

Гены токсинов В. thuringiensis вводили в хромосомную ДНК самых разных микроорганизмов. Так, гены cryIA (с) были введены в ДНК P. fluorescens, которые защищают растения са-

342

ГЛАВА 15

харного тростника от Eldana saccharîna. Трансформация этим геном бактерии Clavibacter xyli subsp. cynodontis, обычно обитающей в ксилеме бермудской травы, приводит к тому, что реком-бинантные бактерии приобретают способность защищать растения кукурузы от мотылька кукурузного (Ostrinia nubilalis).

Бакуловирусы как инструмент биоконтроля

Механизм действия

Бакуловирусы -- палочкообразные вирусы с двухцепочечным ДНК-геномом, инфицирующие разнообразных беспозвоночных. Различные подгруппы этого семейства патогенны для таких отрядов насекомых, как чешуекрылые, перепончатокрылые, двукрылые, сетчатокрылые, ручейники, жесткокрылые и равнокрылые. Некоторые из них играют важную роль в контроле численности определенных насекомых-вредителей в природных условиях. Бакуловирусы использовали в Северной Америке, начиная с 1930-х гг., до появления химических пестицидов в 1960-х гг., для борьбы с вредителями лесов, в том числе с пилильщиком еловым (Neodiprion sertifer), и продолжают применять, хотя и в меньшем масштабе, для контроля популяций непарного шелкопряда (Lymantria dispar)

{табл. 15.3).

Вирион бакуловируса имеет цилиндрический нуклеокапсид, в котором заключена его ДНК. Попав в ядро инфицированной клетки, бакуло-

Таблица 15.3. Некоторые насекомые-вредители, для контроля численности которых применяют бакуловирусы

Насекомое-	Тривиальное	Растение
вредитель	название
Neodiprion sertifer
	Пилильщик	Сосна
	сосновый
	рыжий
Lymantria dispar	Непарный	Широколиственные
	шелкопряд	деревья
Heliothis sρ.	Совка	Хлопок, сорго
	хлопковая
Orgyia	Медведица	Лжетсуга
pseudotsugata		тиссолистная
Cydia pomonella	Плодожорка	Грецкий	орех,
	яблонная	яблоня
Trichoplucia ni	Совка ни	Капуста
Oryctes rhinoceros	Жукносорог	Кокосовый орех

вирусные частицы объединяются, образуя компактную структуру, заключенную в кристаллический белковый матрикс. Он состоит в основном из белка полиэдрина. После гибели инфицированных насекомых в среду выходят миллионы полиэдриновых частиц. Попадая в кишечник других насекомых, они подвергаются действию щелочной среды, матрикс растворяется и высвобождаются инфекционные вирусные частицы. Они проникают в клетки кишечника насекомых, через цитоплазму попадают в ядро, где после удаления нуклеокапсида происходит репликация вируса и образование новых вирусных частиц. Некоторые из них попадают в кровоток насекомого, отшнуровываясь от плазматической мембраны инфицированных клеток, а затем и в другие органы. Обычно насекомое погибает по прошествии 10 раундов репликации вируса, т. е. примерно через 5-6 сут после инфекции, при этом до 25% сухой массы насекомого приходится на долю полиэдрина.

Одно из преимуществ бакуловирусов как инструмента биоконтроля численности насекомых состоит в избирательности их действия. С одной стороны, это означает, что данный бакуловирус может использоваться для контроля численности только определенных насекомых-вредителей. Но с другой, благодаря тому что бакуловирусы эволюционировали в течение многих тысяч лет совместно со своими насекомыми-хозяевами, они научились преодолевать их защитные механизмы, а потому устойчивость к этим вирусам развивается крайне редко - гораздо реже, чем к В, thuringiensis. Более того, устойчивые к бакуловирусам насекомые быстро утрачивают эту способность после того, как прекращают взаимодействовать с вирусами.

Фермеры и садоводы предпочитают использовать один инсектицидный агент, действующий на различных насекомых-вредителей, а не множество инсектицидов. Это означает, что для более широкого применения бакулирусов необходимо расширить круг их хозяев.

Было показано, что при одновременном инфицировании клетки насекомого двумя штаммами бакуловирусов после их репликации иногда появляются новые штаммы, немного отличающиеся по своим действиям от исходных вирусов. Причиной этому является гомологич-

Микробные инсектициды

343

ная рекомбинация между ДНК разных вирусов. Детальное изучение этого явления показало, что рекомбинация осуществляется в пределах участка ДНК длиной всего 79 нуклеотидов, расположенного в гене геликазы р143. Возможно, этот участок и определяет круг хозяев различных бакуловирусов. Учитывая все это, можно предположить, что замена в нем некоторых нуклеотидов позволит создавать бакуловирусы с более широкой специфичностью.

Усиление биоконтроля с помощью генной инженерии

Бакуловирусы не оказывают свое действие мгновенно. В зависимости от условий инфицированное насекомое может погибнуть за период от нескольких дней до нескольких недель. Чтобы ускорить этот процесс, попытались увеличить вирулентность бакуловирусов введением в них чужеродных генов, в результате экспрессии которых произойдет ослабление инфицированного насекомого или его гибель (табл. 15.4). В одном из экспериментов предполагалось использовать ген, экспрессия которого в клетках насекомого-хозяина нарушает его нормальный жизненный цикл.

Известно, что понижение уровня ювенильного гормона у личинок инициирует окукливание и приводит к прекращению их активного питания. Это снижение происходит в результате повышения содержания специфической эстеразы, катализирующей превращение биологически активной формы сложного метилового эфира ювенильного гормона в неактивную кислую

Таблица 15.4. Эффект некоторых генов, введенных в

бакуловирусы для повышения их инсектицидного действия1)

Продукт гена		Влияние,	оказываемое		на
		насекомоехозяина
Диуретический		Уменьшение объема гемолимфы
гормон
Эстераза		Прекращение питания
ювенильного гормона
Токсин	В.	Прекращение питания
thuringiensis
Токсин скорпиона		Паралич
Клещевой токсин		Паралич
Токсин осы		Преждевременная		меланизация,
		медленное прибавление в весе

1) Из работы Maeda, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 313-319, 1995.

форму. Ингибирование активности эстеразы приводит к накоплению in vivo активного ювенильного гормона, личинки дольше остаются на стадии активного питания и в результате достигают гигантских размеров. Разумно было предположить, что при искусственном повышении уровня экстеразы ювенильного гормона произойдет понижение уровня эндогенного активного ювенильного гормона и преждевременное прекращение питания. К тому же было известно. что при уменьшении времени активного питания личинок урожаю наносится меньший ущерб.

Чтобы проверить это предположение, пришлось сначала провести эксперименты по клонированию и экспрессии гена эстеразы ювенильного гормона. Фермент выделили из насекомого Heliothis virescens (совки) и очистили. Определили его аминокислотную последовательность, синтезировали олигонуклеотид, соответствующий одному из сегментов белковой молекулы, и использовали его в качестве зонда для гибридизации. Из библиотеки кДНК H. virescens выцедили кодирующую последовательность для эстеразы ювенильного гормона и встроили ее в геном бакуловируса так, чтобы она находилась под транскрипционным контролем вируса. После обработки таким рекомбинантным бакуловирусом Trichoplusia ni (совки ни), находящейся на первой личиночной стадии развития, содержание ювенильного гормона у насекомого снизилось, а рост личинок резко замедлился по сравнению с таковыми контрольных личинок, обработанных бакуловирусом дикого типа.

К сожалению, применимость этого подхода для повышения эффективности инсектицидного действия бакуловирусов ограничивается тем, что ухудшение питания личинок при повышении уровня эстеразы ювенильного гормона происходит только на первой стадии развития личинок. Личинки, находящиеся на других стадиях развития, гораздо менее чувствительны к обработке бакуловирусами. Таким образом, бакуловирусы, специально сконструированные для экспрессии гена эстеразы ювенильного гормона, эффективны лишь тогда, когда личинки большей части популяции насекомого-вредителя находятся на первой стадии развития, что в естественных условиях почти недостижимо.

344

ГЛАВА 15

Другой подход к повышению эффективности инсектицидного действия бакуловирусов основан на включении в вирусный геном гена мощного насекомое пецифичного токсина, который экспрессировался бы во время цикла вирусной инфекции. В один из штаммов бакуловируса был введен ген насекомое пецифичного нейротоксина, синтезируемого североафриканским скорпионом, Androctonus australis Hector. Этот нейротоксин, не оказывающий никакого действия на мышей, блокирует транспорт ионов натрия в нейронах насекомых-мишеней, что приводит к параличу и смерти. Насекомые, которые были инфицированы бакуловирусом, несушим ген нейротоксина скорпиона, повреждали листья контрольных растений на 50% меньше, чем насекомые, инфицированные бакуловирусом дикого типа.

Клонирование и экспрессия кДНК токсина израильского желтого скорпиона, Leiurus quinquestriatus hebraeus, в бакуловирусе Autographa californica привело к уменьшению времени, которое необходимо для уничтожения 50% личинок контрольного насекомого, со 120 до 78 ч. Кроме того, через 120 ч после инфекции личинки насекомого, обработанные рекомбинантным вирусом, набрали втрое меньший вес по сравнению с личинками, обработанными вирусом ликого типа. Таким обра:юм, рекомби-нантный бакуловирус не только ускорял гибель инфицированных личинок, но и существенно уменьшал способность насекомых повреждать растения.

Не так давно рекомбинантный бакуловирус A. californica, продуцирующий насекомоспецифичный нейротоксин Androctonus australis, был протестирован в полевых условиях, В проведенных ранее лабораторных экспериментах наблюдалось уменьшение времени, необходимого для уничтожения насекомого Т. ni, на 25—50%, но еще больший эффект оказывал рекомбинантный бакуловирус в контрольных полевых испытаниях (рис. 15.7): он быстрее приводил к гибели насекомых, снижал ущерб, причиняемый растениям капусты, сокращал число вредителей в следующем цикле репродукции.

Какую бы эффективность ни обнаруживал конкретный рекомбинантный бакуловирус в

Рис. 15.7. Выживаемость личинок T. ni после обработки листьев капусты бакуловирусом дикого типа или рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим ген нейротоксина скорпиона. На контрольные растения наносили только личинок насекомых. Чем ниже выживаемость, тем больше личинок погибло и тем больше эффективность обработки. Растения обрабатывали бакуловирусами только один раз в начале эксперимента.

лабораторных экспериментах, основным препятствием на пути его широкомасштабного применения является высокая стоимость его препаратов и трудность распространения. Бакуловирусы — это облигатные паразиты, они могут размножаться только в живом организме или в культуре клеток насекомого. Стоимость препаратов бакуловирусов, независимо от того, является вирус рекомбинантным или нет, гораздо выше, чем химических инсектицидов. И тем не менее не исключено, что биологические инсектициды найдут более широкое применение, если учесть, какое неблагоприятное воздействие на окружающую среду оказывают химические инсектициды, т. е. если сопоставить их стоимость и выгоду, которую они дают.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время микробиологические инсектициды получают все более широкое распространение благодаря тому, что они не оказывают вредного воздействия на окружающую среду. Некоторые подвиды бактерии Bacillis thuringien-

Микробные инсектициды

345

sis образуют протоксин, который, попадая в кишечник насекомого, в условиях щелочной среды и под действием пищеварительных протеаз превращается в активный токсин и вызывает гибель насекомого. Летальное действие токсина обусловливается образованием в мембранах клеток кишечника ионных каналов, через которые АТР выходит из клеток. Это приводит к нарушению метаболизма, прекращению питания, дегидратации и т. д. Токсины В, thuringiensis высокоспецифичны в отношении ограниченного числа видов насекомых и нетоксичны для всех остальных; они разрушаются в окружающей среде и поэтому редко оказывают ощутимое влияние на нее, что не способствует отбору устойчивых к ним насекомых. Благодаря всем этим свойствам биологические инсектициды являются перспективными кандидатами на роль агентов, с помощью которых можно контролировать численность насекомых, причиняющих ущерб сельскохозяйственным культурам, и насекомых — переносчиков болезней человека.

Клонированы и охарактеризованы гены различных токсинов В. thuringiensis. Один из таких генов был введен в неспорулирующий штамм Bacillus. При этом ген экспрессировался на всех стадиях развития микроорганизма, а не только на стадии образования спор, когда формируется параспоральный кристалл.

Чтобы расширить специфичность токсина В, thuringiensis, гены различных токсинов встраивали в плазмиды и вводили в хозяйский штамм — либо в составе плазмид с широким кругом хозяев, либо путем интеграции в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Бактерии, несущие два разных токсиновых гена, иногда оказывались токсичными для какого-то третьего вида насекомого-вредителя, а не только для тех двух видов насекомых, на которых действовали продукты исходных генов, С помощью генетических манипуляций был создан рекомбинантный белок, состоящий из двух доменов, кодируемых разными генами В. thuringiensis. Он оказывал двоякое токсическое действие. В ходе другого эксперимента рецепторсвязывающий домен одного токсина был объединен с обладающим токсичностью доменом другого. Есть надежда, что применение таких гибридов уменьшит вероятность появления устойчивых насекомых.

Гены токсинов В. thuringiensis вводили также в различные обитающие в поверхностном слое воды микроорганизмы, которые служат пищей для личинок комаров. Этот подход оказался весьма эффективным для прямой доставки токсинов В. thuringiensis в организм насекомогомишени. Генноинженерными методами были созданы также бактерии, обитающие в ризосфере и экспрессирующие гены токсинов В. thuringiensis, Это позволяет бороться с насекомыми, повреждающими корни растений.

Бакуловирусы патогенны для многих видов насекомых, но каждый их штамм специфичен в отношении небольшого числа видов. Обычно гибель инфицированного насекомого происходит лишь спустя довольно длительное время, поэтому бакуловирусы не очень эффективны как средство контроля численности насекомых. Однако в различные штаммы бакуловирусов можно ввести специфические гены, и тогда вирус может действовать как система доставки гена, обеспечивающего синтез инсектицида в течение всего жизненного цикла вируса. Проведены предварительные испытания в лабораторных условиях, которые дали положительные результаты. Кроме того, в бакуловирус был введен ген нейротоксина, смертельного для насекомых, и были проведены полевые испытания.

ЛИТЕРАТУРА

Ananda Kumar Р., R. P. Shamia, V. S. Malik. 1996.

The insecticidal proteins of Bacillus thuringiemis. Adv. Appl. Microbiol. 42: 1-43.

Baum J. A., T. Mahar. 1995. Regulation of insecticidal crystal protein production in

Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol. 18: 1—12.

Bonning В. С., B. D. Hammock. 1992. Development and potential of genetically engineered viral insecticides. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:455—489.

Bosch D., B. Schipper, H. van der Kleij, R. A. de Maagd, W. J. Mtiekema. 1494. Renirnbirmnl

Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properlies: possibilities for resistance management.

Bio/Technology 12: 915-918.

346

ГЛАВА 15

Calogero S., A. M. Albertini, C. Fogher, R. Marzari, A. Galizâ. 1989. Expressiion of a cloned

Bacillus thuringiensis delta-endotoxin gene in Bacillus subtiiis. Appl. Environ. Microbioi, 55: 446—453.

Caramon T., A. M. Albertini, A. Galizzi. 1991. In vivo generation of hybrids between two Bacillus thuringiensis insect-toxin-encoding genes. Gene 98: 37-44.

Chejanovsky N., N. Zilberberg, H. Rivkin, L. Zfotkin, M. Guervit/. 1995. Functional cxpressk>n of an alpha anti-insect scorpion neu-rotoxin in insect cells and lepidopterous larvae. FEBS Lett. 376: 181-184.

Chungjatupornchai W. 1990. Expression of the mos-quitocidal-protein genes of Bacillus thuringiensis subsp. ismelensis and the herbicide-resistance gene bar in Synechocystis PCC6803.

Curr. Microbioi. 21: 283-288.

Cory J. S., M. L. Hirst, T. Williams, R. S. Hails, D. Goulson, B. M. Green, T. M. Carty, R. D. Possee, P. J. Cay ley, D. H. L, Bishop. 1994. Field trial of a genetically improved baculovirusinsecticide. Nature yjfc 138—140.

Crickmore N., C. Nicholls, Ü. J. Еагр, Т. С. Hodgman,

D. J. Ellar. 1990. The construction of Bacillus

·; '·. ΐ'ί·ί,·:ί .jfr-nns expressing novel сШол.осиЫ

δ-endotoxin combinations. Biochem. J. 270: 133-136.

Croizier G., L. Croizier, O. Argaud, D. Poudevigne. 1994. Extension i>f Autographa californica nuclear polyhcdrosis virus hnst range by interspecific replacement of a short DNA sequence in the pl43 helicase gene. Proc. Nail. Acad. Sei. USA 91: 48-52.

Ferré J-, M. D. Real, J. Van Rie, S. Jansens, M. Peferoen. 1991. Resistance to the Bacillus thuringiensis bioinsecticide in a field population of Ptutella xylostella is due to a change in a midgut membrane receptor. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5119-5123,

Fuxa J. R. 199). Insect control with baculoviruses. Biotechnol. Adv. 9: 425-442.

Ge A. Z., N. I. Shivarova, D. H. Dean. 1989. Location of the Bombyx mon specificity domain on a Bacillus thuringiensis 6-endotoxin protein, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 4037-4041.

Gelernter W., G. E. Schwab. 1993. Transgenic bacteria, viruses, algae and other microorganisms as Bacillus thuringiensis toxin delivery systems, p.

89-104. In P. F. Entwistle, J. S. Cory, M, J. Bailey, S. Higgs (ed.), Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: Theory and Practice. Johm Wiley & Sons, Chichester, United Kingdom.

Hammock B. D., B. C. Banning, R. D. Possee, T. N. Hanzfik, S. Maeda. 1990. Expressioin and effects of the juvenile hormone esterase in a bac-ulovirus vector. Nature 344: 458—461.

Held G. A., L. A. Bulla, E. Ferrari, J. Hoch, A. L Aronson, S, A. Minnich. 1982. Cloning and localization of the lepidopteran protoxin gene of Bacillus fhttringiensis subsp. kurstaki. froc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 6065-6069.

Herrera G., S. J. Snyman, J. A. Thomson. 1994. Construction of a bioinsecticidal strain of

Pseudomonasfluorescens active against the sugarcane borer, Eldana saccharine. Appl, Environ. Microbioi. 60: 682-690.

Kaiman S., K. L. Kiehne, N. Cooper, M. S. Reynoso, T. Yamamoto. 1995. Enhanced production of insccticidal pmlcms in ВасШик Ihuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes. Appl. Environ. Microbioi. 61: 3063-3068.

Lampel J. S., G. L. Canter, M. B. Dimock, J, L, Kelly, J. J. Anderson, B. B. Uratani, J. S. Foulke, Jr., J. T. Turner. 1994. Intcgrative cloning, expression, and stability of the crylA(c) gene from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki in a recombinant strain of Clavibacter xyli subsp. cynodontis. Appl. Environ. Microbioi. 60: 501-508.

Lereclus D., H. Agaisse, M. Gominet, J. Chaufaux. 1995. Overproduction of encapsulated insectici-dal crystal proteins in a Bacillus thuringiensis spoOA mutant. Bio/Technology 13: 67-71.

Lereclus D., A. Delécluse, M. M. Lecadet. 1993. Diversity of Bacillus thuringiensis toxins and genes, p. 37-69, In P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey, S. Higgs (ed.), Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: Theory and Practice. John Wiley & Sons, Chichester, United Kingdom.

Liu J. T., M. J. Sui, D. D. Ji, I. H. Wu. C. C. Chou, С, С. Chen. 1993. Protection from ultraviolet radiation by melanin of mosquitocidal activity oi iiacillux ihurmgiensis var. tsraelensis. J. Invertebr. Pathol.62: 131-136.

Микробные инсектициды

347

Uu J. W., W. H. Yap, T. Thanabalu, A. G. Porter.

1996. Efficient synthesis of mosquitocidal toxins in Asticcacaulis excentricus demonstrates potential of gramnegative bacteria in mosquito control, Nat. Biotechnoi 14: 343-347.

Maeda S. 1995. Further development of recnmbi-nant baculoviniK insecticides. Curr. Opln. Biotechnoi. 6:313-319.

McCutchen B, F., P. V. Choudarj, IÎ. Crenshaw,

D.Maddox, S. G. Kamita, N. Palekar, S. Vclrath,

E.Fowler, B, D. Hammock, S. Maeda. 1991. Development of a recombinant baculovirus expressing an insect-selective neurotoxin: potential for pest control. Bio/Technology 9: 848-852.

Mettus A. M., A. Macafuso. 1990 Expression of Bacillus thuringiensis й-endntoxin genes during vegetative growth. Appl. Environ. Microbiol. 56: 1128-1134.

Murphy R. C., E. S. Stevens. 1991. Cloning and expression of the crylVD gene of Bacillus thuringiensi!, suhsp. Kraelenxis m the cyanobac-• .im Л, -ut 'uin νιΐί>··ΙηψΙΐ(·, tut Ά Ί ;-mu i:.'. resulting larvicidal activity, Appl. Environ. Microbiol. 58: 1650 1655.

Otxikowic/ M. ti., F. J. Perlak, K. Kusaiio-Kretymer, E. J. Mayer, S. L· Bolten, L· S. Watrud. 1986.

Tn5-mediated integration of the delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis into the chromosome of root-colonizing pseudomonads. J. Bacterial. 168: 982-989.

Obukowicz M. G., F. J. Perlak, K. Kusano-Kretzmer, E. J. Mayer, L. S. Watrud. 1986. Integration of the delta-endotoxin gene of Bacillus ihuringiensis into the chromosome of root-colonizing strains of pseudomonads using Tn5. Gene 45: 327-33).

Priest F. G. 1992. Biological control of mosquitoes and other biting flies by Bacillus .sphaericus and Bacillus thuringiensls. J. Appl. Bacterial. 72: 357-369.

Schnepf H. E.f H. R. Whiteley. 1981. Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli. Proc. Natt. Acad. Sei. USA 78: 2893-2897.

Stewart L. M. D., M. Hisrt, M. L. Ferber, A. T. Merryweather, P. J. Cayley, R, D. Possee. 1991. Construction of an improved baculovirus insecticide containing an insect-specific toxin gene. Nature

352: 85-88.

Thanabalu T., J. Hindley, S. Brenner, C. Oei, C. Berry. 1992. Expression of the mosquitocidal toxins of Bacillus sphaericus and Bacillus Ihuringiensis subsp. israelensis by recombinant Caulobacter crescentus, & vehicle for biological control of aquatic insect larvae. Appl. Environ. Microbiol. 58:905910.

Thiery I., L. Nicholas, R. Kippka, N. Tandeau de Marsac. 1991. Selection of cyanobacteria isolated from mosquito breeding sites as a potential food source for mosquito larvae. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1354-1359.

Tomalski M. D., L. K. M U 1er. 1991. Insect paralysis by baculovirus-mediated expression of a mite neurotoxin gene. Nature 352: 82 -84.

Van Rie J., W. H. McGaughey, D. E. Johnson, B. I). Harriett, H. Van Mdlaert. 1990. Mechanism of inscel resistiinee of the microbial inscelieide Bacillus thuringiensis. Science 247: 72—74.

Wood Η. Α., R. R. Granados. 1991. Genetically engineered baculoviruses as agents fbr pest control.

Annu. Rev. Microbiol. 45: 69-87.

Yap W. H., T. Thanabalu, A. G. Porter. 1994. Expression of mosquitocidal toxin genes in a gas vacuolatcd strain i>t Ancylobactcr aquaticus. Appl. Environ. Microbiol. 60; 4199-4202.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Каковы преимущества биологических инсектицидов перед химическими?

2.Почему токсин Bacillus thuringiensis не токсичен для человека?

3. Какой подход вы использовали бы для идентификации гена протоксина Bacillus thuringiensis subsp. israilensis? Какое практическое применение может найти этот ген?

4.Как выяснить, где локализован ген определенного протоксина: в плазмиде или в хромосомной ДНК B. thuringiensis?

5.Как с помощью генной инженерии можно улучшить полезные свойства того или иного протоксина В. thuringiensis?

6.Как, используя методы генной инженерии, повысить эффективность бакуловирусов как инсектицидных агентов?

7.Каким образом можно расширить видоспецифичность токсинов?

348

ГЛАВА 15

8.Какую информацию вы можете получить, зная, к какому классу относится тот или иной белок Cry?

9.Как бы вы модифицировали белок Cry, чтобы уменьшить вероятность появления насекомых, утойчивых к токсину?

10.Почему бактерия Asticcacaulis excentricus является весьма привлекательным микроорганизмом для осуществления в ней экспрессии генов токсинов В. thuringiemis?

11.Как расширить круг насекомых, инфицируемых данным бакуловирусом?

ГЛАВА 16.

Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов

Для получения коммерческих продуктов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов в двух областях: молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молекулярных биологов заключается в идентификации, изучении свойств, модификации нужных генов и создании эффективных систем их экспрессии в клетках микроорганизмов, которые можно будет использовать для промышленного синтеза соответствующего продукта, а задача биотехнологов — в обеспечении условий оптимального роста нужного рекомбинантного микроорганизма с целью получения продукта с наибольшим выходом. На заре развития молекулярной биотехнологии ученые наивно полагали, что переход от лабораторного синтеза к промышленному — это вопрос простого увеличения масштаба, т. е. условия, оптимальные для малых объемов, будут оптимальными и для больших, так что достаточно просто взять больший реактор и соответственно больший объем культуральной среды.

Такое упрощенное представление не соответствует действительности. Например, аэробные микроорганизмы хорошо растут в обычной колбе на 200 мл при аэрации ее содержимого с помощью мешалки мощностью 300 Вт. Если просто увеличить объем «колбы» до 10 000 литров, то потребуется мешалка мощностью 15 МВт. Ее мотор будет размером с дом, а при перемешивании выделится столько тепла, что микроорганизмы попросту сварятся. Этот простой пример может не во всем убедить биотехнологов, однако они точно знают, что проблема промышленного культивирования микроорганизмов не сводится к пропорциональному увеличению масштаба лабораторного эксперимента. Конечно, увеличить размер реактора (биореактора, ферментера) совершенно необходимо, поскольку для получения 10 000 л клеточной суспензии не имеет смысла использовать 50 000 отдельных колб на 200 мл. Однако помимо этого для получения максимального выхода как в малых (от 1 до 10 л), так и в больших (>1000 л) биореакторах необходимо оптимизировать множество параметров: температуру, pH, интенсивность и способ перемешивания культуры и — в случае аэробных организмов — концентрацию кислорода. При этом надо иметь в виду, что как правило оптимальные условия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биореактора.

Есть и другие очень важные соображения. В реакторе должен поддерживаться достаточный уровень стерильности и, кроме того, необходимо создать условия, предотвращающие утечку генетически измененных микроорганизмов. Чтобы иметь возможность быстро и легко изменять условия в ходе ферментации, реактор должен быть снабжен контрольно-измерительной аппаратурой, позволяющей непрерывно отслеживать значения как можно большего числа параметров. Поскольку при стерилизации может изменяться состав среды (например, могут разрушаться витамины), важно убедиться в том, что он остался оптимальным для роста нужных микроорганизмов.

Как правило, промышленная ферментация и очистка продукта — процессы многоступенчатые (рис, 16,1). Обычно процедура начинается с приготовления и стерилизации культуральной среды и оборудования. Сначала выращивают исходную культуру (5—10мл), затем инкубируют ее во встряхиваемой колбе (200—1000 мл), после

350

ГЛАВА 16

чего переносят в ферментер для посевного материала (10—100 л) и, наконец, в промышленный ферментер (1000—100 000 л). По завершении ферментации клетки выделяют из культуральной среды центрифугированием или фильтрацией. Если продукт локализован внутри клеток, последние разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукт из осветленной среды, Секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.

Рост микроорганизмов

Микроорганизмы можно выращивать в ферментере периодического действия, в ферментере периодического действия с добавлением субстрата

Рис. 16.1. Обобщенная схема процесса промышленной ферментации. Выделяемый продукт находится либо в клетках, либо в культуральной среде, но не в обеих фракциях одновременно, так что дальнейшие манипуляции проводят с одной из этих фракций.

или в непрерывной культуре (рис. 16.2). В первом случае микроорганизмы выращивают в стерильных условиях без добавления в ходе ферментации свежей культуральной среды. Во втором случае по ходу ферментации к культуре периодически добавляют увеличивающиеся количества питательных веществ, при этом культуральную среду не удаляют до окончания процесса. При непрерывной ферментации свежая культуральная среда поступает в ферментер непрерывно, и параллельно отводится такой же объем клеточной суспензии. Во всех случаях через среду при необходимости продувают кислород (обычно в виде стерильного воздуха), добавляют пеногаситель и (если это нужно) кислоту или основание.