Печатается по решению секции

Научно-методического совета

Казанского университета

Автор: к.б.н. Аскарова А.Н.

-

Основные представления о днк

Дезоксирибонуклеиновые кислоты - это линейные, полимерные молекулы, представляющие последовательность химически связанных между собой нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из трех компонентов: азотистого основания, углевода и остатка фосфорной кислоты. Последовательность нуклеотидов в ДНК - это информация, определяющая порядок синтеза и аминокислотную последовательность белков, в соответствии с универсальным для всех живых существ триплетным генетическим кодом; это наследственная информация, определяющая рост, развитие, дифференцировку и все характерные свойства данного организма. ДНК - это единственный тип молекул, способный к репликации, что и обеспечивает преемственность генетической информации в ряду поколений.

Чем сложнее клетка, тем больше генетической информация, и, как правило, больше ДНК (рис.1). Например, вирусы содержат одну молекулу ДНК или РНК, сравнительно небольшого размера. Бактериальные клетки имеют более сложную структуру и больше ДНК. Клетка кишечной палочки E.coli содержит единственную молекулу ДНК, состоящую из более чем 4»10⁶ пар нуклеотидов (ММ 26«10⁹кДа) длиной 1.4 мм, что в 700 раз больше самой клетки. Количество ДНК в пикограммах на 1 клетку составляет: у человека - 6.8; у курицы - 2.3; дрожжевых клеток -0.05; Е. coli-0.01.

ДНК человека содержит 3»10⁹ нуклеотидов в 46 хромосомах -плотно упакованных, суперскрученных за счет взаимодействия с ядерными белками структурах. Общая дина молекулы ДНК составляет около 2 метров. Одна хромосома содержит 1 молекулу ДНК. В большинстве соматических клеток ДНК представлена двумя копиями - по одной в каждой хромосоме. В клетке присутствует 23 пары хромосом, 22 из которых гомологичны друг другу - и одна пара (X и Y) - половые хромосомы. Небольшая часть ДНК (около 0.5 %) обнаружшается в митохондриях; в каждой клетке присутствует порядка 1000 митошндрий, содержащих по 10 кольцевых митохондриальных хромосом, сходных с хромосомами бактерий.

В качестве единиц измерения размеров ДНК очень часто использует также понятия: килобазы (kb) - тысяча пар оснований и мегабазы (Mb) - последовательность ДНК в миллион пар оснований.

■

3

ДНК могут существовать как в виде одноцепочечных (однонитевых), так и в виде двухцепочечных (двунитевых) молекул. Двухцепочечные молекулы ДНК образуются за счет двух водородных связей между аденином и тимином (А=Т) и трех водородных связей между гуанином и цитозином (G=C). Образование комплементарных пар всегда строго специфично: А всегда спаривается с Т, a G - с С. Водородные связи между парами нуклеотидов достаточно непрочны, так что двухспиральную структуру ДНК можно разрушить нагреванием, резким изменением рН (рН<3 или рН>10), или понижением концентрации соли. Поскольку спаренные цепи не связаны между собой ковалентно, после разрыва всех водородных связей две полинуклеотидные цепи ДНК полностью разделяются -диссоциируют. Процесс разделения цепей называется денатурацией или плавлением; денатурация ДНК происходит в узком интервале температур и характеризуется усилением оптического поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований. Среднюю точку температурного диапазона, при которой происходит разделение цепей ДНК, называют точкой плавления и обозначают Тпл. (рис.2). S-образные профили плавления показывают, что денатурация ДНК - кооперативный процесс, т.е. каждое предшествующее изменение повышает вероятность последующего. Когда ДНК находится в растворе при физиологических условиях, Тпл. лежит в диапазоне 80-95 °С. Например, ДНК человека имеет Тпл.= 81-82 °С; а для ДНК E.coli Тпл.=90.5 °С. Зависит Тпл. от состава оснований; пары G-C, связанные тремя водородными связями и имеющие большую свободную энергию образования, оказываются более тугоплавкими, чем пары А-Т, связанные двумя водородными связями. Зависимость Тпл. от состава оснований линейна; при каждом увеличении содержания G-C пар значение Тпл. увеличивается на 0.4 °С. Так, ДНК на 40 % состоящая из G-C пар будет денатурировать при Тпл. около 87 °С в обычных условиях, тогда как ДНК, содержащая около 60 % G-C пар, при тех же условиях будет иметь Тпл. около 95 °С. Для определения Тпл. строят график зависимости оптического поглощения от температуры раствора ДНК (рис.2); в дальнейшем можно определить соотношение в ДНК (G+C) и (А+Т) нуклеотидов. Выведена эмпирическая зависимость между GC-содержанием и Тпл. в стандартном солевом растворе (0.15 М NaCl+0.15 М цитрата Na):

G+C=(Tnn. - 69.3).2,44.

Важное значение на температуру плавления оказывает ионная сила раствора; Тпл. возрастает на 16.6 °С при каждом десятикратном увеличении концентрации моновалентных катионов. Значение Тпл. сильно

5

меняется при добавлении в реакционную смесь веществ, дестабилизирующих водородные связи, например, формамид. Присутствие формамида позволяет снизить Тпл. до 40 °С. и тем самым избежать дополнительных повреждений ДНК.

Рис.2. Типичная кривая тепловой денатурации (плавления) ДНК; показано, что изменение оптического поглощения при 260 нм зависит от температуры. Тпл. обычно определяется как температура, при которой оптическое поглощение увеличивается на 50%.

Ранее процее денатурации ДНК считали практически необратимым, но к 1960 г. Д.Мармур и П. Доти в Гарвардском университете показали, что при инкубации одиночных комплементарных цепей в течение

б

нескольких часов в условиях, близких к денатурирующим (около 65 °С), они рекомбинируют (реассоциируют) с образованием нативных двойных спиралей - этот прием называют отжигом. Ренатурация в таких условиях высокоспецифична, совершенные двойные спирали образуются только в том случае, когда последовательности оснований в двух ренатурирующих цепях строго комплементарны.

Процесс ренатурации ДНК происходит в две стадии: сначала короткие комплементарные последовательности двух цепей случайно соединяются друг с другом и образуют двухспиральный участок; затем область спаривания распространяется вдоль молекулы и образуется длинная двухцепочечная структура. Завершается этот процесс полным восстановлением первоначальных свойств, утраченных при денатурации ДНК.

Различные внешние и внутренние факторы влияют на чувствительность ДНК к денатурации:

• длина ДНК;

• содержание (G+C), а точнее распределение частоты их встречаемости в соседних участках длиной в 10 пар нуклеотидов;

• местная последовательность или конформационное состояние соседних участков;

• наличие катионов, анионов и их концентрация;

• рН;

• температура;

• наличие солей и неводных растворов;

В то же время при менее жестких условиях отжига (при более низкой температуре) между частично комплементарными молекулами могут формироваться несовершенные двойные спирали.

Если исследуемые нуклеиновые кислоты взяты из двух различных источников (или это молекулы ДНК и РНК), то это явление называют гибридизацией. Определяя степень сплавляемости молекул ДНК разных видов, можно определить и степень их гомологии. Принцип гибридизации заключается в совместной инкубации двух одноцепочечных препаратов нуклеиновых кислот и последующем измерении количества образовавшихся дуплексов.

1