Методы исследования в медицинской бактериологии

61

Рисунок 50 – Устройство для окраски и промывания препаратов.

Рисунок 51 – Пружинный зажим для предметных стекол.

Рисунок 52 – Подставка для предметных стекол.

Рисунок 53 – Набор склянок с пипетками для растворов красок.

Вместо пружинного зажима для предметных стекол используется также анатомический пинцет. В настоящее время растворы красителей выпускаются в виде рабочих растворов в полиэтиленовых флаконах.

Уход за световым микроскопом предусматривает соблюдение следующих правил:

1.Защита микроскопа от пыли колпаком.

2.Исключение прикасания пальцами оптических поверхностей.

3.Чистка и смазка при необходимости движущихся частей с применением специальной смазки.

4.Регулярная чистка предметного столика.

62

5. Очистка линз от иммерсионного масла после каждого использования иммерсионной системы тканью, смоченной ксилолом или бензолом. Запрещается использовать эфир и ацетон.

В таблице 9 представлены основные неисправности светового микроскопа и способы их устранения.

Таблица 9 - Неисправности микроскопа, их причины и способы устранения

Неисправность	Возможная причина	Способ устранения
Макровинт вращается с	Неправильная регулировка	Отрегулировать
трудом	Загрязнение реечного	Почистить, смазать
	механизма
Микровинт не движется в	Винт находится в крайнем	Установить объектив 8х и
одну из сторон	положении	микровинт в среднее
		положение
Расфокусировка при	Объективы плохо	Ввинтить объективы
незначительном движении	ввинчены в револьвер
микровинта	К объективу пристало	Применить менее вязкое
	покровное стекло	масло
Неясное пятнистое	Загрязнение линз окуляра,	Проверить вращением
изображение	объектива или	окуляра и перемещением
	предметного стекла	препарата, очистить
Неясное изображение	Загрязнение фронтальной	Очистить ксилолом линзу
	линзы объектива
	Остатки масла на	Удалить
	препарате
	Предметное стекло лежит	Перевернуть стекло
	препаратом вниз
Поле зрения освещено не	Луч света перекрыт	Убрать держатель
полностью	держателем светофильтра
	Объектив не зафиксирован	Зафиксировать объектив
Поле зрения освещено не	Неправильно расположено	Исправить положение
равномерно	зеркало
Нерезкие, яркие пятна в	Загрязнения поверхности	Установить и устранить,
изображении микроба	линз, воздух в	открыть диафрагму
	иммерсионном масле

5.1.2. Приготовление препаратов для микроскопирования

Микроскопическое исследование бактерий проводят с целью выявления их морфологических и тинкториальных особенностей. В зависимости от состояния микробов в препарате различают препараты живых и неживых (убитых, фиксированных, окрашенных) микробов. Препараты, приготовленные из живых микробов, используют для изучения размеров и формы клеток, способа их

63

размножения, подвижности, спорообразования, структуры колоний и других признаков. Для повышения контрастности изображения клеток микробов и изучения их субклеточных структур микроорганизмы окрашивают различными красителями.

Для микроскопического изучения формы, размеров микробов (морфологические признаки) и их отношения к красителям (тинкториальные свойства) готовят препарат на предметном стекле. В качестве исследуемого материала используют инфицированный материал от больного (кровь, гной, мокрота и т. д.), чистую бактериальную культуру, выросшую на плотной или в жидкой питательной среде, другие материалы. Из таких материалов готовят препарат – мазок. Кроме того, можно использовать отпечаток пораженной ткани прижизненно или отпечаток ткани отдельных органов при посмертной диагностике заболевания (препарат – отпечаток). Для приготовления препаратов используют предметные стекла. Для длительного сохранения препаратов применяют покровные стекла.

Подготовка предметных и покровных стекол. Прежде чем приступить к приготовлению микроскопических препаратов, необходимо обработать предметные и покровные стекла. Они должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Доказательством хорошего обезжиривания предметных и покровных стекол является равномерное распределение капли жидкости на их поверхности. Перед использованием стекло фламбируют.

Новые стекла, не бывшие в употреблении, вначале моют в воде, затем выдерживают в смеси спирта с эфиром (соотношение 1:1). Из смеси спирта и эфира стекла фламбируют над пламенем горелки, чем и достигается их обезжиривание. Новые стекла можно подготовить к работе путем кипячения их в течение 10 минут в 1% растворе натрия гидрокарбоната (соды), промывания в дистиллированной воде (добавляя к ней до 0,5% соляной кислоты для нейтрализации) и окончательного ополаскивания в дистиллированной воде.

Стекла, бывшие в употреблении, обрабатывают в концентрированной серной кислоте или в смеси серной кислоты с калием двухромовокислым (хромовой смеси). Смесь готовят путем добавления к серной кислоте 5% калия двухромовокислого. Смесь взбалтывают и оставляют на сутки, после чего он приобретает темно-оранжевое окрашивание. Хромовая смесь - сильный окислитель, хорошо удаляющий органические загрязнения. Стекла в моющую смесь погружают на 1-2 часа, затем промывают в проточной воде, переносят в 5% раствор натрия гидрокарбоната и кипятят в течение 30 минут. После ополаскивания в чистой воде их высушивают в сушильном шкафу или при комнатной температуре. Обработанные стекла хранят в банке с притертой пробкой сухими, со спиртом или в смеси спирта и эфира (в соотношении 1:1).

Приготовление мазка для микроскопирования. Мазок для микроскопирования должен быть тонким, иметь определенную форму и размеры. Материал в мазке должен быть распределен равномерно как в центре, так и на периферии. Хорошо приготовленный тонкий мазок должен быть размером 1-2 см2 и иметь круглую или овальную форму.

Для приготовления мазка из культуры с плотной питательной среды на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды. Соблюдая правила асептики, бактериологической петлей берут немного материала (с

64

булавочную головку) и погружают его в каплю, слегка растирая в ней. Остаток культуры в петле сжигают на пламени горелки. Остудив петлю, сначала ее краем равномерно размешивают культуру в капле, а затем равномерными круговыми движениями распределяют каплю смеси на площади примерно в треть предметного стекла. После приготовления мазка петлю сразу же фламбируют в пламени горелки и помещают в штатив.

Для приготовления препарата из жидкой микробной культуры

бактериологическую петлю прожигают на пламени горелки и каплю материала наносят на поверхность стекла, соблюдая при этом правила асептики. Легкими круговыми движениями распределяют каплю по стеклу, затем препарат высушивают на воздухе, а петлю прожигают. Для приготовления препарата в этом случае можно использовать пастеровскую пипетку, которую после использования помещают в дезинфицирующий раствор.

Порядок приготовления препарата из микробной суспензии представлен на рисунке 54.

Рисунок 54 – Схема приготовления препарата – мазка из микробной суспензии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Аналогичным образом готовят мазки из жидкого клинического материала – ликвора, мочи.

65

Из мокроты и гноя мазки готовят следующим образом: материал петлей наносят на середину предметного стекла, затем плотно прикрывают его другим предметным стеклом. Раздвигая предметные стекла в противоположных направлениях за свободные концы, получают два равномерных мазка (рисунок 55).

Рисунок 55 – Приготовление мазка из мокроты. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Мазок из крови готовится следующим образом. Предметным стеклом прикасаются к капле крови, выступающей при уколе. Затем стекло берут в левую руку, а правой рукой к капле придвигают под углом в 45° стекло со шлифованной стороной, по краю которой капля крови равномерно растекается. Плотно прижимая стекло и не меняя угла его наклона, продвигают его по предметному стеклу, получая равномерный мазок (рисунок 56).

1 2

Рисунок 56 - Приготовление мазка крови: 1 – взятие капли крови на предметное стекло; 2 – мазок из капли делается шлифованным ребром другого стекла.

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Правильно приготовленный мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, располагаться на 1–1,5 см от краёв, занимать 2/3 длины стекла и заканчиваться “метёлочкой”. Густые мазки нецелесообразно использовать, так как в них морфология клеток плохо различима.

Для приготовления мазка крови “толстая капля” на середину предметного стекла наносят каплю крови и петлёй распределяют ее по площади около 1 см2. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания.

Для приготовления мазка – отпечатка стерильным предметным стеклом прикасаются к пораженной поверхности, затем высушивают и фиксируют препарат. При исследовании патологического материала (ткань, орган) ножницы, смоченные в спирте, обжигают на пламени горелки, остужают их и срезают кусочек ткани

66

(органа). Срезом ткани прикасаются к предметному стеклу, оставляя след – отпечаток.

Высушивание мазков. После приготовления препарат высушивают обычно при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает равномерно и быстро. Если же высушивание препарата замедлено, то для ускорения высыхания препарат подогревают, держа стекло мазком вверх, в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Это нужно производить крайне осторожно, не допуская перегревания мазка, так как при этом может произойти слишком быстрое свертывание белков в цитоплазме микробной клетки, что приводит к нарушению ее структуры. Высушивание можно проводить также в термостате при температуре 36-38°С. Высушивание проводится до появления сплошного белого налета на поверхности предметного стекла.

Фиксирование препарата. Высохший препарат фиксируют – закрепляют на стекле. Цели фиксации препарата: инактивация микробов и обеспечение безопасности дальнейшей работы; плотное прилегание мазка к стеклу; разрушение микробных мембран для лучшего восприятия красителей. Фиксацию проводят с использованием физического или химического способа. Чаще пользуются физическим способом: препарат 2-3 раза проводят над пламенем горелки, не допуская сильного нагревания стекла.

Из фиксирующих химических средств используют эфир, этиловый или метиловый спирт, формалин, смеси формалин-спирт, спирт-эфир, ацетон. Для фиксации высушенный препарат помещают в стаканчик с фиксирующей жидкостью (или 1-2 капли жидкости наносят на препарат) и выдерживают в среднем 3-5 минут. Затем мазок промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Иногда препараты фиксируют парами альдегидов или кислот. При фиксировании парами формалина предметные стекла помещают на стеклянные палочки или спички мазком вниз. При слабом подогревании формалина в чашке Петри образуются пары, которыми и фиксируется мазок.

По окончании фиксирования на стекле с обратной стороны мазка восковым цветным карандашом или маркером обводят границу (зону) препарата, чтобы после окраски точно знать место его нахождения.

5.1.3. Микроскопирование микробов в живом состоянии

Препараты живых микробов используют для изучения размеров и формы клеток, способа их размножения, подвижности, процесса спорообразования, структуры колоний и других признаков. Особенность этих препаратов состоит в том, что в них микробы находятся в естественном, неизмененном состоянии. Преимуществом этого метода является то, что наблюдение микробов в живом виде позволяет выявить ряд свойств, не обнаруживаемых у фиксированных микробов, например, их подвижность.

Вместе с тем микроскопирование микробов в живом состоянии имеет ряд недостатков: низкая контрастность живых клеток, трудность исследования неокрашенных микробов ввиду их малой величины, невозможность длительного

67

наблюдения за микробной клеткой в связи с ее быстрым перемещением в поле зрения (как при активной ее подвижности, так и в силу броуновского движения). В связи с этим исследование микробов в живом состоянии дает возможность получить только самое общее представление об их морфологии. Однако исследование в живом состоянии крупных микроорганизмов (грибки, простейшие и др.) позволяет изучить тонкую структуру их клетки лучше, чем в окрашенном препарате. При этом обращение с живыми патогенными микробами требует исключительной осторожности и соблюдения правил техники безопасности (например, обязательное погружение препарата в дезинфицирующий раствор после микроскопирования).

Изучение колоний микробов. Для изучения формы и структуры колоний микробов их выращивают на прозрачных плотных питательных средах, разлитых в чашки Петри, дно которых ровное, гладкое, без царапин и деформаций, создающих искаженные изображения или помехи проходящему свету. Колонии изучают в проходящем свете или при боковом освещении, обращая внимание на форму краев и поверхности, структуру, размер, окраску колоний. Для микроскопии используют в этом случае объектив малого увеличения.

Препарат “отпечаток колонии”. Для изучения состояния клеток микробов в колонии, их взаимного расположения, формы спор и спороносцев мицелиальных грибов готовят препарат “отпечаток колонии”. С этой целью из плотной питательной среды вырезают стерильным скальпелем блок с единичной колонией размером 1x1 см. Блок извлекают и переносят на предметное стекло колонией кверху. К колонии прикладывают второе обезжиренное сухое предметное стекло так, чтобы отпечаток колонии пришелся на его середину, слегка прижимая к колонии. Затем верхнее стекло с отпечатком колонии переворачивают отпечатком кверху, на отпечаток наносят каплю воды, перемешивают. Полученную суспензию накрывают покровным стеклом, и препарат микроскопируют.

Чаще всего для исследования микробов в живом состоянии готовят препараты “раздавленной капли” или “висячей капли”. В некоторых случаях применяют прижизненную (витальную) окраску микробов. Раздавленную или висячую каплю микроскопируют с помощью сухих систем или с иммерсионной системой в затемненном поле зрения - при суженной диафрагме и опущенном конденсоре. Лучше всего их микроскопировать в микроскопе с темным полем зрения.

Препарат “раздавленная капля” готовится следующим образом. На середину сухого чистого предметного стекла с соблюдением правил асептики наносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой каплю дистиллированной воды или физиологического раствора. В эту каплю бактериологической петлей вносят микробную массу из колонии и тщательно перемешивают, получая взвесь бактерий. Жидкую культуру наносят на стекло пастеровской пипеткой. Каплю осторожно накрывают чистым покровным стеклом так, чтобы в суспензии не образовались пузырьки воздуха. Для этого краем покровного стекла прикасаются к поверхности предметного стекла рядом с каплей, наклоняют покровное стекло над каплей и опускают его. Иногда покровное стекло слегка прижимают к предметному стеклу, чтобы выдавить пузырьки воздуха из препарата (рисунок 57).

68

Рисунок 57– Приготовление препарата “раздавленная капля”.

Правильно приготовленная раздавленная капля заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, но при этом жидкость не выступает за края покровного стекла. Препарат микроскопируют. С таким препаратом можно работать в течение 2-4 часов до появления признаков подсыхания. После микроскопии препарат помещают в дезраствор. Иногда этот препарат называют препаратом “придавленная капля”. Если требуется рассматривать препарат продолжительное время, то края покровного стекла предварительно смазывают вазелином.

Препарат “висячая капля”. Для более длительного (в течение 1-2 суток) изучения живых микробов готовят препарат “висячая капля”, в котором предотвращают высыхание препарата посредством помещения капли в герметичную камеру (рисунок 58). В этих условиях изучают размножение, спорогенез и другие свойства живых микробов.

Рисунок 58 – Процесс приготовления препарата “висячая” капля.

На середину стерильного обезжиренного покровного стекла наносят каплю жидкой культуры микроба. Края лунки чистого стерильного предметного стекла с лункой смазывают вазелином. Предметное стекло переворачивают лункой вниз, слегка прижимают его к покровному стеклу с каплей так, чтобы капля оказалась в центре лунки, а лунка герметично закрылась покровным стеклом. После этого предметное стекло вместе с покровным переворачивают. В этом случае капля должна свободно свисать в лунку предметного стекла, не соприкасаясь с ее дном и краями.

Препарат рассматривают в слегка затемненном поле (диафрагму сужают), что увеличивает контрастность неокрашенных форм. При необходимости препарат помещают в термостат для роста культуры и последующего изучения. После микроскопирования препарат помещают в дезраствор.

69

5.1.4. Микроскопирование микробов в окрашенном состоянии

Микроскопический метод в диагностике инфекционных болезней носит ориентировочный характер, так как позволяет выявлять наличие микробов в препарате, определять форму, размеры, взаимное расположение клеток и их структуру (морфологические свойства) а также способность бактерий окрашиваться определенными красителями, то есть способность воспринимать красители (тинкториальные свойства). Ценность бактериоскопического метода состоит в простоте выполнения методик, доступности материалов, в быстроте получения результатов. Однако специфичность микроскопического метода мала, так как многие микроорганизмы по морфологии близки друг другу. Чувствительность этого метода также ограничена, так как концентрация микробных клеток в 1 мл материала должна составлять в среднем 10·105 клеток и более.

Для бактериоскопического исследования используют световую, фазовоконтрастную, темнопольную, флюоресцентную (люминесцентную) и электронную микроскопию в зависимости от вида возбудителя. При световой микроскопии требуется окрашивание исследуемого материала. С этой целью применяют как простые (щелочной синькой, фуксином), так и сложные методы окраски (по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Лёффлеру и др.).

Для повышения контрастности изображения микробных клеток и изучения их субклеточных структур микроорганизмы окрашивают различными красителями органической природы. Изучение морфологии микробов в окрашенном состоянии является наиболее распространенным в микробиологии методом. Он позволяет изучить морфологические особенности микробов и дает возможность найти различия между ними, иногда даже точно определить изучаемый микроорганизм. Этот метод удобен в практической работе, так как значительно легче производить исследование, пользуясь убитыми микробами, чем живыми (особенно при изучении патогенных микроорганизмов). Он весьма доступен благодаря сравнительной простоте техники окрашивания.

Окрашивание микробов не является механическим процессом проникновения краски в микробную клетку. Механизм окраски микробов следует рассматривать как физико-химический процесс (адсорбцию краски микробной клеткой). В ряде случаев различные составные части микробной клетки избирательно окрашиваются различными красителями.

Фиксированные и окрашенные препараты неживых микробов не опасны, сохраняются без изменений в течение нескольких недель.

Этапы приготовления препаратов окрашенных микробов:

1.Подготовка предметного стекла: мытье, обезжиривание, высушивание и фламбирование. На подготовленном стекле делают необходимые надписи.

2.Приготовление мазка микробов на предметном стекле. При приготовлении препарата каплю суспензии микробов тщательно и равномерно распределяют по поверхности предметного стекла петлей, создавая пленку в виде квадрата площадью 1x1 или 1,5х1,5 см. Распределение суспензии по стеклу проводят до подсыхания жидкости, появления белых пятен по краям пленки. После этого бактериологическую петлю фламбируют и ставят в штатив.

70

3.Высушивание мазка. Влажный мазок высушивают при комнатной температуре, в струе теплого воздуха высоко над пламенем спиртовки или в термостате при температуре 36-38°С до появления сплошного белого налета на поверхности предметного стекла. Нагревать мазок на пламени горелки для его высыхания нельзя, так как при этом происходит деструкция микробных клеток.

4.Фиксирование микробов в мазке. Фиксирование препаратов проводят физическим или химическим способом. При использовании химического способа высушенный препарат помещают в стаканчик с фиксирующей жидкостью или 1-2 капли фиксирующей жидкости наносят на препарат. Экспозиция - 3-5 минут. В качестве фиксирующих химических средств чаще всего используют эфир, этиловый или метиловый спирт, смесь спирта с эфиром в соотношении 1:1 (смесь Никифорова).

Физический способ фиксации заключается в том, что высушенный препарат медленно проводят 2-3 раза через верхнюю часть пламени горелки. Затем препарат остужают на воздухе (рисунок 59).

Рисунок 59 – Физический способ фиксирования препарата.

5. Окрашивание микробов в препарате. Если мазок тонкий и трудно определить, на какой стороне стекла он находится, достаточно слегка поцарапать мазок петлей: должен остаться след на месте мазка. Препараты для микроскопирования окрашивают органическими красителями. После окрашивания избыток красителя удаляется промыванием струей воды.

Для окрашивания микробов применяются анилиновые краски, поступающие в продажу в виде сухих порошков, концентрированных растворов или рабочих растворов. В лабораториях из сухих порошков сначала готовят насыщенные спиртовые растворы красителей, сохраняющиеся в течение длительного времени, но сами по себе не пригодные для окраски бактерий. Поэтому из насыщенных растворов готовят разведенные (рабочие) растворы, которые применяют в повседневной практике.

Количество красителя при окрашивании препарата должно быть таким, чтобы покрывать всю поверхность мазка; излишек краски затрудняет его последующее микроскопирование. Обычно достаточно несколько капель краски, наливаемых при