2. Пцр в режиме реального времени

– метод, который используется для определения концентрации ДНК. В данном методе реализованы общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что при проведении Real-Time ПЦР одновременно происходят амплификация, детекция и количественное определение специфической последовательности ДНК в образце. Также отличительными чертами данного метода являются отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматические регистрация и интерпретация полученных результатов. Измерение происходит в реальном времени после каждого цикла амплификации. Можно определять непосредственно количество копий ДНК, либо количество копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов. Для детекции продуктов амплификации в режиме реального времени применяются следующие наиболее распространенные подходы: 1) использование модифицированных олигонуклеотидов (зондов), которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК [TaqMan-зонды (данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы; 2) использование флуоресцентных красителей, интеркалирующих в двухцепочечные молекулы ДНК и 3) использование двух зондов с резонансным переносом.

2. ДНК-гибридизация

• Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.

• Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.

• Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК гибридизуются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная» молекула ДНК.

Анализ скорости отжига (= гибридизации) одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.

2. Биочипы

Точнее всего биочипы описывает английское название DNA-microarrays, т.е. это организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе в специальных ячейках. Профессионалы называют этот носитель «платформой». Платформа — это чаще всего пластинка из стекла или пластика (иногда используют и другие материалы, например кремний), на которую наносится ДНК, способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

Характерные размеры ячеек современных микрочипов лежат в пределах ~50-200 микрон, общее число ячеек на чипе составляет 103-105, а линейные размеры чипа ~1см.

Смысл метода

Иммобилизируемая ДНК наносится на поверхность через игольчатые растры (пины) механического робота или с помощью технологии струйного принтера. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения. На биочипе, в дальнейшем, гибридизуют молекулы ДНК, меченые красителем. Гибридизуемая ДНК в растворе метится с помощью флуоресцентной или радиоактивной метки. Интенсивность флуоресценции в ячейках измеряют с помощью сканера или люминесцентного микроскопа, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью. Данные о характере гибридизации также можно получить также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др.

Принцип работы

В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизированной ДНК лежит точное соответствие между комплементарными ДНК по правилу Уотсона-Крика, А-Т, Г-Ц. Если соответствие между нуклеотидами иммобилизированной и гибридизуемой ДНК точно удовлетворяет условиям комплементарности, то образующиеся дуплексы будут термодинамически наиболее устойчивы. В результате при конечных температурах их будет больше, чем несовершенных дуплексов с нарушением условий комплементарности, и соответственно совершенным дуплексам будет отвечать более сильный сигнал флуоресценции. В выявлении и сопоставлении наиболее ярко светящихся ячеек и заключается работа прибора-анализатора биочипов.