2. Метод обратной генетики

Метод обратной генетики – это инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярных механизмах наследственности.

Принцип:

Внесение мутаций в РНК-геномы вирусов, в ходе чего РНК переводится в форму кДНК, а потом получается измененная РНК. Схематически: РНК-геном – кДНК – измененная кДНК – измененный РНК-геном – измененный вирус. Такой вирус отличается от исходного вируса не случайными, а целенаправленно внесенными мутациями. С практической точки зрения возможность манипуляции вирусной генетической информацией может быть использована для: 1) изучения генетики вирусов и роли каждого гена, каждого генного участка, каждого фактора, влияющего на функции генов; 2) создания новых полезных штаммов, например вакцинных штаммов и на их основе – вакцин.

2. Секвенирование вирусных геномов

Данные о нуклеотидной последовательности генома являются наиболее полной молекулярно-биологической характеристикой вируса и позволяют точно идентифицировать исследуемый штамм, проанализировать степень родства с другими вирусами, а также отличить от практически идентичных вариантов того же вируса. Таким образом, имея данные о полной нуклеотидной последовательности генома вируса, исследователь способен определить его абсолютную идентичность или отличия, даже минимальные, от других вирусов, а в некоторых случаях и воссоздать исходный вирус.

Принцип метода

Принцип состоит в использовании двух основных положений:

А) Если к ДНК-матрице добавить специфичный праймер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, ДНК-полимеразу и проводить реакцию в подходя­щих солевых и температурных условиях, то все синтезирующиеся цепи ДНК будут начинаться с одинаковой стартовой точки.

Б) Если в такую смесь добавить какой-либо (из 4 возможных) дидезоксирибонуклеотид, например ддАТФ, то все растущие цепи будут специфически терминироваться после его внесения. В результате продукты реакции будут представлять собой набор одноцепочечных ДНК, начинающихся от одной точки и заканчивающиеся на ддАТФ. Для идентификации данных, полученных таким способом, необходимо электрофоретическое разделение этих смесей фрагментов в условиях позволяющих отличать сигналы индивидуальных фрагментов, различающихся по длине на нуклеотидных остаток.

Пилотной задачей проекта всегда является получение хотя бы небольшой достоверной нуклеотидной последовательности изолята, для которого планируется определение полной последовательности генома. Это позволяет подтвердить правильность отношения вируса к данной группе, найти максимально гомологичную родственную последовательность в базе данных (использовать ее в дальнейшем для сравнения и выбора праймеров) и подобрать хотя бы один праймер для дальнейшей работы, в котором можно быть полностью уверенным.