4. Методы идентификации выделенных вирусов

Проводят по следующим признакам:

а) патологическим изменениям в чувствительных живых системах;

б) антигенным свойствам вирусов в серологических реакциях с противовирусными видовыми и типовыми сыворотками (основная и точная идентификация);

в) наличию НК в ПЦР;

г) результатам исследования морфологии вирусов при электронной микроскопии.

Идентификация по антигенной структуре.

Реакция нейтрализации РН основана на нейтрализации инфекционной активности вирусов при связывании со специфическими антителами.

Готовят серийные разведения из вируссодержащего материала и добавляют к ним специфическую сыворотку. Смесь вирус-сыворотка инкубируют при 37⁰С в течение 1ч. После этого заражают культуру ткани, куринные эмбрионы, животных. Контроль — живая система, зараженная вирусом. Реакция положительная, если подавляется ЦПД в культуре клеток, нет бляшкообразования, патологических изменений в эмбрионах и животных.

Цветная проба — один из вариантов РН. При положительной реакции противовирусные антитела блокируют размножение вируса в культуре клеток и метаболиты клеток изменяют цвет индикатора.

Реакция торможения гемагглютинации РТГА.

Блокируют вирусные гемагглютинины специфическими антителами. Можно рассматривать как один из вариантов РН. РТГА используют как для серологической диагностики, так и для идентификации геммаглютинирующих вирусов. Образуется компактный осадок эритроцитов вместо «зонтика» гемагглютинации. Реакцию проводят на полистироловых пластинах и оценивают по отсутствию склеивания эритроцитов, добавленных к смеси вируса и специфической сыворотки.

Реакция торможения гемадсорбции — РТГадс, используется для идентификации гемадсорбирующих вирусов. Основана на нейтрализации адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, инфицированных вирусами. О видовой принадлежности вируса судят по отсутствию адсорбции эритроцитов в опыте при типичной гемадсорбции в контрольных пробирках.

Другие реакции для идентификации вирусов в клеточных культурах: РПГ — реакция преципитации в геле, РСК, РИФ, РОНГА — реакция обратной непрямой гемаглютинации, ИФА, РИА со специфическими иммунными противовирусными сыворотками или моноклональными АТ.

Идентификация по другим признакам. Патологические изменения в живых системах (культура клеток, куриные эмбрионы, животные), морфологические свойства вирусов будут приведены при рассмотрении конкретных вирусных инфекций. Молекулярно-биологические методы диагностики врусных инфекций даны в теме: «Молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний» (Метод молекулярной гибридизации, ПЦР, Саузерн- и Нозерн -блоттинг).

Серологическая диагностика вирусных инфекций основана на выявлении в крови больного противовирусных антител в серологических реакциях с использованием специфических вирусных антигенов — диагностикумов или специфических тест-систем.

В основе серологических реакций лежит реакция взаимодействия вирусных антигенов и гомологичных антител в жидкой среде (РСК, РТГА, РНГА, РОНГА, РТОНГА, РИА), в геле (РПГ, РРГ, РВИЭФ), при фиксации одного из ингредиентов на твердой фазе (ИФА, ИЭМ, РГадсТО, РИФ, РГадс, РТГадс).

Для серологических реакций, в частности, для выявления антител, асептически берут сухим стерильным шприцем 15-20 мл крови. Сыворотку хранят при -20⁰С. Нарастание титра антител определяют в парных сыворотках, которые берут в начале и в разгар болезни или в период рековалесценции. Для постановки диагноза нарастание титра антител должно быть в 4 раза и более.

Для повышения чувствительности серологических реакций, т.е. повышения чувствительности тестов антигены или антитела адсорбируют на эритроцитах (РНГА, РОНГА, РТОНГА, РГадсТО, РРГ), метят их ферментами (ИФА), радиоактивными изотопами (РИА, РПГ), флюорохромами (РИФ) или же используют лизис эритроцитов при взаимодействии АГ и АТ в присутствии комплемента (РСК, РРГ). Серологические реакции при диагностике вирусных инфекций имеют свои особенности и модификации. Например, РСК (на холоду +4⁰С), РРГ (в агарозном геле).

Методы экспресс-диагностики вирусных инфекций - их отличает высокая специфичность и чувствительность.

РИФ — применяют в прямом и непрямом вариантах для выявления вируса в материале от больного, в культуре клеток и организме животных.

ИЭМ — иммунная электронная микроскопия позволяет обнаружить скопление вирусных частиц, связанных с антителами (вирусы гепатитов А и В и мн. др.).

РВИЭФ — реакция встречного иммуноэлектрофореза — применяется для обнаружения в сыворотке больных поверхностных антигенов (например HBsAg у больных генатипом В) и др. вирусных антигенов, имеющих отрицательный заряд (но не антител!!!). РгадсТО — реакция гемадсорбции на твердой основе —это сочетание ИФА и РНГА, высокочувствительный анализ.

Лунки полистироловых панелей обрабатывают иммунной сывороткой и вносят в них суспензию исследуемого материала, содержащего антиген. Через час лунки промывают буфером, добавляют эритроциты, покрытые специфическим иммуноглобулином и через час определяют наличие гемаглютинации.

Если есть в материале специфический антиген, он соединяется с сывороткой на поверхности лунок и связывает иммуноглобулины на поверхности эритроцитов. Происходит агрегация эритроцитов (гемагглютинация). Эта модификация реакции применяется для ротавирусов и других вирусов при исследовании фекалиев.

Молекулярно-биологические методы. ПЦР и другие методы генодиагностики, о них уже говорилось в соответствующей теме лекции.