3) Детерминистские и немишенные эффекты малых доз. Кривые «доза-эффект».

Зависимость «доза-эффект» имеет немонотонный вид (S-образный)

I(D)=αD+βD²

Зависимость доза-эффект выхода многих типов повреждений, носящи нелинейный (линейно-квадратичный) характер.

На этой кривой к малым дозам будут относиться те, которые ниже доз, вызывающих выход большинства повреждений за счет «квадратичного» компонента.

ЕРФ – ультрамалые дозы естественного (природного) радиационного фона.

I – эффекты облучения в сверхмалых дозах (гиперрадиочувствительность);

II – эффекты облучения в малых дозах, вызывающих стимуляцию биологических процессов (гормезис)

III – развитие структурно-функциональных повреждений при облучении в средних сублетальных дозах;

IV – условная граница между большими и средними дозами для млекопитающих составляет 1-2.5 Гр. Пунктир – линейная экстраполяция из области больших доз

Радиобиологические эффекты в области малых доз

 

Повреждения ДНК

Радиация, в том числе в малых дозах, вызывает повреждения ДНК ряда типов: однонитевые разрывы (ОР), двунитевые разрывы (ДР), модификацию (повреждение или потерю) основания, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок. Подавляющую часть составляют ОР, большинство которых репарируется живой клеткой в течение нескольких мин после радиационного воздействия, а почти все остальные (за небольшим исключением) — в течение нескольких часов (см. в [61]).

В таблице 4.1 представлен выход основных повреждений ДНК, большинство типов которых можно зафиксировать в том числе при дозах до 100 мГр включительно.

 

Таблица 4.1 – Выход повреждений ДНК в клетках млекопитающих после воздействия редкоионизирующей радиации (из [61])

 

Тип повреждения	Выход (число на клетку на Гр^–1)
ОР	500–2000*
ДР	1–40*; каноническое — 40
Модификации оснований (окисление, потеря)	250–700**
Сшивки ДНК-белок	150

* Диапазон значений, полученных разными авторами.

** Диапазон значений для различных типов повреждений.

 

Несколько выше степень повреждения ДНК для излучений с высокой ЛПЭ. Число ДР возрастает с увеличением ЛПЭ и для a-частиц превышает эффект g-излучения в той же дозе в 1,2–2,7 раза, достигая для фибробластов 50–60 на 1 Гр [61].

До 1990-х гг. разрешимости и чувствительности имеющихся методов не хватало для уверенной регистрации повреждений ДНК различного типа после облучения в малых дозах; даже применительно к наиболее простому и массовому их типу — однонитевым разрывам (см., к примеру, [68]). Однако к концу 1990-х гг. произошло экстраординарное повышение чувствительности методики, обусловленное разработкой нового способа регистрации числа ДР по числу фокусов (сайтов) фосфорилирования гистона γ-H2AX, которые можно выявить по флуоресценции в специальных условиях [69, 70]. Это позволило зарегистрировать ДР при облучении даже в очень малых дозах (до 10 мГр) [44].

Выход исходных радиационных повреждений ДНК линейно зависит от дозы излучения в широком диапазоне, начиная от очень малых и заканчивая большими дозами.

Установлено, что ведущую роль при подавления неправильных воссоединений концов ДНК играет хроматин и модификации гистонов, главной из которых является фосфорилирование С-концевых серинов в гистоне Н2АХ и его аналогов, открытое В. Боннером в 1998 г. (см. в [69]). Фосфорилирование гистона Н2АХ в хроматине может быть ключевым событием, контролирующим точность репарации ДР и стабильность хромосом. Показано, что фосфорилирование Н2АХ после облучения в основном проводит протеинкиназа АТМ, дефектная при наследственном заболевании атаксия-телеангиэктазия, которая быстро активируется при образовании в клетке нескольких ДР [71]. Фокусы γ-Н2АХ можно обнаружить через несколько минут после облучения, их максимальное число выявляется через 30–60 минут и затем медленно уменьшается, что происходит в течение нескольких часов после облучения [72].

Понятно, что, поскольку этим методом ДР выявляются в специальных условиях даже после облучения в очень малых дозах, то диапазон малых доз — зона уверенной регистрации эффектов по выходу ДР (рисунок 4.1).

 

ДР являются одним из наиболее простых типов самых опасных повреждений ДНК — кластерных или комплексных, для которых характерна затрудненная репарация. Кластерный эффект имеет место тогда, когда участки ионизации (повреждений) распределяются вдоль молекулы ДНК в компактные кластеры сложных, так называемых комплексных повреждений. Такой эффект более присущ для плотноионизирующего излучения, чем для редкоионизирующего, но и для последнего имеются значительные отличия в эффекте по сравнению со спонтанными повреждениями ДНК свободными радикалами. Количество кластеров прямо зависит также от дозы излучения [61].

Комплексные (кластерные) повреждения ДНК отличаются по их способности к репарации клеткой. Так, уровень ДР, индуцированных в клетке сразу после облучения, слабо коррелирует с последующим биологическим эффектом [73]. С этим эффектом коррелируют оставшиеся нерепарированными ДР, хотя количество таковых и может быть очень мало. Таким образом, среди общего пула двунитевых разрывов выделяются различные классы, отличающиеся по способности к репарации [74]. В результате появилась гипотеза, согласно которой именно кластеры повреждений («комплексные повреждения») ответственны за летальные и/или мутагенные (канцерогенные) эффекты ионизирующей радиации [75, 76, 77].

Теоретически какое-то количество кластерных повреждений ДНК должно индуцироваться сколь угодно малыми дозами радиации. Действительно, выход комплексных повреждений в подвергавшихся воздействию рентгеновского излучения клетках человека почти строго линейно зависит от дозы в диапазоне как средних и больших, так и самых малых доз (в последнем случае — при облучении клеток в условиях, исключающих репарацию ДНК). Данные из основополагающих работ [78, 79] представлены на рисунках 4.2 и 4.3.

 

Индукция кластерных (комплексных) повреждений — главный фактор, обусловливающий специфичность поражающего эффекта радиации. Даже наиболее простые комплексные повреждения — ДР — радиация индуцирует не менее чем в 10⁵ чаще (как долю от суммы всех повреждений ДНК), чем естественный клеточный метаболизм [80]. Таким образом, потенциальный молекулярный механизм канцерогенного эффекта в области малых доз был продемонстрирован на ряде объектов in vitro (см. рисунки 4.2 и 4.3). Несколько позже было показано, что малые дозы редкоионизирующего излучения способны повышать уровень кластерных повреждений и in vivo.

В [81, 82] опубликованы данные исследования фокусов гистона γH2AX в головном мозгу и ткани легких мышей, облученных фотонным микропучком энергией 6 MV в дозах 0,1–1,0 Гр (рисунок 4.4). После облучения мышей в дозе 0,1 Гр было зарегистрировано 0,8 фокуса γ-H2AX на клетку, а после воздействия в дозе 1 Гр — 8 фокусов, т.е., зависимость оказалась линейной, начиная с диапазона малых доз [81, 82].

  

В 2007 г. параллельно с изучением культур лимфоцитов и фибробластов человека при облучении in vitro проводились исследования индукции фосфорилирования гистона H2AX у индивидуумов после компьютерной томографии (дозы порядка 20–100 мГр) [45]. Клетки подвергали иммуногистохимическому окрашиванию после обработки антителами к гистону γ-H2AX и к другому белку клеточного ответа на повреждения ДНК — 53BP1. Было обнаружено, что .даже такое низкодозовое радиационное воздействие, как CT, в ранние сроки (исследован срок в 5 мин после процедуры) приводит к отчетливому формированию ДР в лимфоцитах, которое по величине сравнимо с эффектом облучения данных клеток in vitro в дозе 20 мГр [45].

Необходимо заметить, однако, что показатель поврежденности ДНК после CT быстро снижается до практически исходного уровня вследствие репарации ДР и только после воздействия в дозе 100 мГр увеличение все еще существенно даже в максимальный исследованный временной срок — 30 мин после облучения [45].

 

Репарация ДНК, гиперрадиочувствительность и индуцированная радиорезистентность

В области малых доз имеется уверенная индукция репарации ДНК, с чем и связан один из механизмов радиоадаптивного ответа и явления гиперрадиочувствительности [10, 61, 83]. На рисунке 4.5 представлена экспериментальная кривая выживаемости облученных клеток, на которой видны участки гиперрадиочувствительности (связанной с недостаточной индукцией репарации ДНК [84]) и радиоадаптивного ответа (когда репарация индуцируется — индуцированная радиорезистентность [61]). Из рисунка 4.5 видны эффекты в области малых доз.

 

 

Радиоадаптивный ответ и гормезис

Радиоадаптивный ответ четко стимулируется малыми дозами радиации (таблица 4.2).

Равным образом, многочисленные гормезисные эффекты на экспериментальных объектах in vitro и in vivo, а также отдельные эпидемиологические данные для человека, продемонстрированы преимущественно именно для области малых доз [53, 61, 85].

 

Таблица 4.2 – Примеры адаптации к облучению редкоионизирующей радиацией) [53, 61, 85].

 

Объект	Характеристика и диапазон доз адаптирующего облучения
Семена растений	Острое, 70 и 250 мГр
Ооциты Drosophila	Острое, 0,2–20 мГр
Культура клеток рыбы	Острое, 19–190 мГр
Культура клеток кожи мышей (клетки m5s)	Острое, 0,1–0,5 Гр
Фибробласты китайского хомячка (клетки CH V79)	Острое, 0,1–0,4 Гр
Клетки HeLa	0,05–0,1 Гр, но не 5 мГр
Эмбриональные фибробласты мышей (клетки C3H 10T1/2)	0,02–1,5 Гр
Фибробласты человека	Острое, 5–500 мГр
Лимфоциты крыс	Острое, 5–100 мГр
Лимфоциты мышей	Хроническое, 50–100 мГр
Лимфоциты человека	Острое, 5–500 мГр (оптимум 50 мГр)
	Пролонгированное и хроническое, 10–100 мГр
Нормальные, раковые и подвергшиеся трансформации клетки человека	Острое, 10 мГр
	Хроническое, 10–100 мГр
Органы мышей in vivo (сперматоциты, спленоциты и клетки костного мозга)	Острое, 0,3–100 мГр
Мыши	Острое, 50 мГр —2,5 Гр
	Пролонгированное, 24 и 120 мГр
	Дробное пролонгированное (4 дозы по 50 мГр)
Крысы	Хроническое, 29 мГр —0,78 Гр

 

Апоптоз

Апоптоз — это явление программируемой клеточной гибли, сопровождаемое набором характерных цитологических признаков (маркеров апоптоза) и молекулярных процессов, имеющих различия у одноклеточных и многоклеточных организмов. Термин «программированная клеточная смерть» отражает функциональное назначение этого процесса, представляющего естественную часть жизни многоклеточного организма, связанного с метаморфозом и развитием

Один из механизмов радиоадаптивного ответа и гормезиса на уровне организма связывают с апоптотическим устранением популяции исходно радиочувствительных клеток костного мозга (остаются, таким образом, только относительно радиорезистентные клеточные единицы) [10, 45, 61, 84]. Для лимфоцитов человека апоптоз показан начиная с области малых доз [10, 61, 86, 87].

 

Немишенные эффекты: нестабильность генома и «эффект свидетеля»

Данный документ [AU17]9, в отличие от двух предыдущих, посвящен углубленному рассмотрению именно РИНГ, «эффекта свидетеля» и кластогенного действия излучения. Никаких существенных, кардинальных изменений с 2004 г. по 2006 г. в проектах не обнаружено. Поэтому вполне можно разобрать три проекта документа НКДАР так, как будто это окончательная редакция (конец 2008 г.). Продекларированная цель Сообщения состоит в суммировании свидетельств о немишенных эффектах радиации (когда действие обусловлено не прямым попаданием, а опосредованно) in vitro и in vivo. Приложением же изысканий, в принципе, должны являться новые аспекты в области оценок рисков лучевого канцерогенеза и интерпретации радиоэпидемиологических данных. В данном документе весьма подробно разбираются основные теоретические закономерности в рамках как РИНГ, так и «эффекта свидетеля». Представлен анализ экспериментальных публикаций по РИНГ in vitro, in vivo и при трансгенерационной передаче нестабильности генома. Отдельно рассмотрены опыты на мышах и эпидемиология людей. Документ кажется крайне ценным для мировой радиобиологии. Но преимущественно — для фундаментальной, теоретической радиобиологии. Ибо вновь, как и в соответствующих документах МКРЗ и BEIR, совершенно нет никаких дозовых закономерностей. Не оценена роль анализируемых эффектов для практики радиационной медицины, радиационной безопасности и техногенного облучения. Главные выводы авторов Сообщения НКДАР по немишенным эффектам радиации [AU17] весьма общи и неоднозначны. Сказано, что, теоретически, и РИНГ, и «эффект свидетеля», вследствие повышения числа затронутых клеток, способны «усилить биологическую эффективность конкретной дозы облучения», но это и так ясно, исходя из сути данных феноменов. Отмечается также, что, поскольку немишенные эффекты продемонстрированы и in vivo, «пришло время пересмотреть концепции дозы облучения и размера мишени» («It is time to re-examine the concepts of radiation dose and target size»). И что «эти эффекты могут иметь значение для здоровья облученных людей». Но далее в том же абзаце, без перерыва, говорится о неотъемлемости использования радиации в практике человеческой деятельности, и что «биологические системы продемонстрировали замечательную способность адаптироваться ко всяким неблагоприятным факторам, включая малые дозы радиации». Затем сказано, что высокие дозы радиации, понятно, могут вызывать неоплазию, как путем прямого повреждения, так и посредством немишенных эффектов. И те, и другие должны найти свое место при оценке радиогенных рисков (получается, что для высоких доз облучения). Вот, пожалуй, и все применительно к практическому приложению немишенных эффектов для радиационной безопасности.

Аналитические исследования Котерова А.Н. показали, что радиационно-индуцированная нестабильность генома экспериментально продемонстрированаin vitro и in vivo почти исключительно для доз свыше малых (более 100 мГр). И только если в опыт брались аномальные, радиочувствительные или дефектные биологические объекты (клетки или сверхчувствительные линии мышей), то была показана отсроченная нестабильность генома и для доз до 100 мГр [20, 21, 22, 23, 25, 88]. Таким образом, для относительно нормальных, не модельных объектов, радиационная нестабильность генома малыми дозами не индуцируется, что отражено в том числе в специальной монографии [25]. В 2011–2012 г. НКДАР в документе, посвященном механизмам действия малых доз радиации [89], ссылается на главные обзоры (Котеров А.Н., 2005; 2009 [22, 88]), упоминая, что для нормальных объектов радиационно-индуцированной нестабильности генома по таким-то источникам не обнаруживается. Тем более, что аналитические выводы из более ранних работ Котерова А.Н. подтверждены в последние годы зарубежными исследовательскими группами [90].

Равным образом, работами Котерова А.Н. [91], хотя и менее масштабными, чем в предыдущем случае, было обнаружено, что повреждающий эффект свидетеля (по гибели клеток и нарушениям генома) для области малых доз также отсутствует, если только в опыт брались не клеточные линии с аномальной радиочувствительностью и нестабильностью. Для области малых доз уверенно демонстрируется положительный (т.е., адаптирующий и гормезисный) «эффект свидетеля» [91].

В результате можно сделать вывод, что границей для четкого выявления повреждающих немишенных эффектов радиации может быть назван порог (по крайней мере практический) в 100 мГр. А начиная с 0,3–0,5 Гр (особенно с 0,5 Гр) немишенные эффекты начинают воспроизводиться четко и однозначно, даже для нормальных объектов. Иными словами, немишенные эффекты радиации — прерогатива средних и, особенно, больших доз, но не малых и не очень малых доз.

 

Тем не менее, другие названные выше радиобиологические эффекты для области малых доз выражены отчетливо (апоптоз, индукция повреждений ДНК и их репарация, увеличение частоты нестабильных аберраций хромосом и пр.) [10, 61]. Однако в стохастические эпидемиологические последствия эти радиобиологические феномены реализуются слабо.

Нестабильность генома

• Часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой на протяжении многих поколений возникают de novo (без доп. облучения!) аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза

• В отличие от перманентной геномной нестабильности, приводящей к некоторым наследственным болезням, радиационно-индуцированная нестабильность генома имеет ряд особенностей:

• не определяется возникновением стойких нарушений в первичной структуре ДНК;

• не определяется копированием в клеточном потомстве радиационных повреждений ДНК родительских клеток,

• не имеет клонального характера;

• может возникать в клетках, не подвергавшихся облучению (эффект свидетеля);

• Нестабильность может проявляться в отдаленные сроки после облучения (иногда через сотни циклов деления).

• Сохранение НГ на протяжении десятков поколений клеток животных было впервые показано при облучении в больших дозах;

• В 1970-80 е гг. отечественными учеными было показано, что НГ может проявляться и у потомков клеток, облученных в малых дозах;

• НГ проявляется как после действия плотноионизирующего, так и редкоионизирующего излучения

• У многоклеточных организмов НГ проявляется в увеличении числа (частоты) соматических мутантных клеток

• Повышение частоты генетических нарушений у потомков облученной клетки

• Отсутствует зависимость НГ от дозы в большом диапазоне доз (возникает после облучения в широком диапазоне доз, включая малые (<20 сГр), особенно при воздействии плотноионизирующих излучений)

• НГ регистрируется у лиц, облученных в малых дозах на атомных производствах и проживающих на загрязненных территориях в отдаленные сроки – увеличение генных и хромосомных мутаций в лимфоцитах периферической крови

• Спектр мутаций в отдаленные сроки (одиночные и парные фрагменты) отличается от мутаций в непосредственно облученных клетках (дицентрики, кольцевые хромосомы)