696

потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ. В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопроводной воде и микроэлементы не добавляют.

По физическому состоянию различают: жидкие, плотные, сыпучие среды.

Жидкие среды широко применяют в биотехнологии для культивирования продуцентов.

Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение изолированных колоний) для хранения культур, количественного учета микроорганизмов. Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и кремнекислый гель. Агар-агар - сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не использует его в качестве питательного субстрата. В воде агар-агар образует гели которые плавятся при 1000С, а затвердевает при 400С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы при любой подходящей для их роста температуре.

Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К ним относятся: отруби, кварцевый песок, разваренное пшено.

Стерилизация питательных сред, оборудования и воздуха

Стерилизация всех компонентов биотехнологического процесса, соприкасающимися с чистыми культурами микроорганизмов – важнейший этап. Под стерилизацией понимают полное удаление жизнеспособных организмов, что достигается двумя группами методов. Первая группа основана на воздействии летальных факторов – высокой температуры, ионизирующего излучения, химических веществ, вторая – на механическом отделении посторонних микроорганизмов (контаминантов) – стерилизующая фильтрация,

82

только микроорганизмы, но и клетки (ткани) растений, животных и человека и их метаболиты, в частности биополимеры.

Биологические объекты продуцируют (производят) важные целевые продукты (все их разнообразие представлено на Рис.1), поэтому их называют продуцентами, наиболее важными из которых в настоящее время являются бактерии и грибы.

Известно множество способов классификации живых организмов по различным признакам. Для промышленной биотехнологии наиболее важной является классификация по способам питания (по трофике) (Табл.1), поскольку вклад исходных продуктов (субстратов) в цену производимых продуктов в биотехнологии является определяющим.

С позиций сегодняшней экономики наиболее рентабельны продуценты, использующие в качестве источников энергии, углерода и доноров электронов соответственно свет и неорганические вещества, т.е. – фотолитоавтотрофы. К этой подгруппе относятся растения и бактерии, например цианобактерии – значительная группа крупных грамотрицательных бактерий, способных к фотосинтезу, сопровождающемуся выделением кислорода, и азотфиксации. Рассматривается возможное применение цианобактерий, в частности спирулины, в создании замкнутых циклов жизнеобеспечения, а также как массовой кормовой или пищевой добавки. К фотоорганогетеротрофам относятся зеленые бактерии (хлоробактерии) – фотосинтетические анаэробные организмы, способны жить в отсутствии атмосферного кислорода. К хемолитоавтотрофам относятся аэробные тиобациллы рода Thiobacillus, они окисляют сульфиды, серу и некоторые из них железо(II), используя углекислый газ в качестве источника углерода. Эти бактерии осуществляют бактериальное выщелачивание металлов из

11

www.mitht.ru/e-library

сульфидных руд. Фотолитоавтотрофы и хемолитоавтотрофы растут на доступных питательных неорганических средах, однако применение их ограничено, они не способны продуцировать полезные продукты, кроме биомассы и ограниченного ряда веществ. Большинство продуцентов важнейших биотехнологических продуктов являются хемоорганогетеротрофами, т.е. способны расти на сложных органических питательных средах. Многие из них используют в качестве источника углерода и энергии сахара, органические кислоты, спирты и др. Такие питательные среды дороги, поэтому в биотехнологии часто используются отходы пищевой, целлюлозо-бумажной и других отраслей промышленности, а также сельского хозяйства.

3.2. ВИРУСЫ

Вирусы – образующиеся биологическим путем надмолекулярные комплексы, способные к самовоспроизведению в клетках-хозяевах. Вирусы – облигатные паразиты. Их воспроизведение возможно только в клетках-хозяевах. Вне клеток вирусы (вирионы) являются неживыми, имеют правильную форму (Рис.), состоят из молекулы нуклеиновой кислоты (или ДНК, или РНК) и окружающей ее белковой оболочки – капсида. Вирусы специфичны в отношении хозяев. По природе клетки-хозяина вирусы делят на вирусы бактерий – бактериофаги (ДНК, РНК); вирусы растений (РНК); вирусы животных и человека (ДНК, РНК) (Рис.3,4). Внутри клетки вирусная частица становится внутриклеточным паразитом

Рис.3. Форма и величина вирионов некоторых вирусов.

12

видам микроорганизмам требуются различные составы питательных веществ.

Рис.30. Принципиальная схема биотехнологического процесса.

По составу питательные среды подразделяются на 2 группы - натуральные и синтетические.

Натуральными называются среды, которые состоят из натуральных пищевых продуктов (молоко, яйца, мясо). Большинство из них применяют в виде экстрактов или настоев. Эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав. Они используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. Примерами служат мясопептонный бульон, почвенная вытяжка, картофельная среда. Среди натуральных сред широкое применение нашли: меласса – отход свеклосахарного производства, применяется как основной источник углерода, кукурузный экстракт, отруби и др.

Синтетические среды - это среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Для разработки синтетических сред необходимо знать

81

www.mitht.ru/e-library

Исходные ростовые вещества (субстраты)

Ростовые вещества используют в составе питательной среды, который подбирают таким образом, чтобы присутствовали все химические элементы для построения клетки в такой форме, в которой продуценты способны их усваивать. Количественный состав питательной среды зависит от многих факторов, главным из которых является стехиометрия клеточного роста. Основой конструирования питательных сред является простой материальный баланс превращения в процессе биосинтеза низкомолекулярных субстратов, например глюкозы и аммиака, в биомассу и внеклеточные продукты. Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Разнообразие таких источников очень велико, так как микроорганизмы потребляют широкий спектр органических соединений, начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан, метанол, диоксид углерода, моносахариды и заканчивая природными биополимерами. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста нуждаются в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов (калии, магнии. цинке, железе, меди, молибдене, марганце и др.). Как правило, эти компоненты заранее вносятся в питательные среды в виде минеральных солей перед началом ферментации. Исключение составляют газообразные компоненты.

Для культивирования микроорганизмов используют специальные питательные среды, которые должны содержать необходимые питательные вещества и являться оптимальной средой обитания микроорганизмов.

Универсальных сред, пригодных в равной степени для всех микроорганизмов, не существует. В закономерности от особенностей обменных процессов (фотосинтез, способы получения энергии) отдельным

80

13

www.mitht.ru/e-library

По характеру взаимодействия бактериофага с клеткой все бактериофаги делятся: на вирулентные (литические), вызывающие продуктивную инфекцию и лизис бактериальной клетки и умеренные (лизогенные), вызывающие латентную инфекцию и ассоциацию генома вируса с бактериальной хромосомой (Рис.5). Умеренные фаги, в отличие от вирулентных, не вызывают гибели бактериальных клеток и при взаимодействии с ними переходят в неинфекционную форму фага, называемую профагом. Профаг – геном фага, ассоциированный с бактериальной хромосомой. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке в неограниченном числе поколений.

Рис.4. Модель бактериофага Т2. А. Фаг с вытянутым чехлом до адсорбции. Б. Фаг с сократившимся чехлом после адсорбции и инъекции.

Бактериальные клетки, содержащие в своей хромосоме профаг, называются лизогенными. Профаг в лизогенных бактериях самопроизвольно или под влиянием различных индуцированных агентов может переходить в вегетативный фаг. В результате такого превращения

14

этапе – предферментационном (Рис.30) – готовят питательную среду для культивирования продуцента, стерилизуют ее для полного удаления жизнеспособной посторонней микрофлоры, получают инокулят – посевную дозу продуцента, моют и стерилизуют оборудование для культивирования.

Основная стадия биотехнологического производства

– стадия культивирования продуцента или ферментации (биотрансформации) (Рис.30). На этой стадии происходит рост продуцента и биосинтез целевых продуктов. Используют разные технологии культивирования – в жидкой питательной среде (глубинное культивирование) и на твердой питательной среде (поверхностное культивирование). Основным продуктом стадии глубинной ферментации является культуральная жидкость – суспензия клеток продуцента в питательной среде, содержащей растворимые продукты метаболизма (метаболизм - обмен веществ, химические превращения, протекающие от момента поступления питательных веществ в живой организм до момента, когда конечные продукты этих превращений выделяются во внешнюю среду). Целевой продукт может содержаться как в клетках (биомассе), так и в растворе (внеклеточные продукты). Этими вариантами определяется схема выделения и очистки продукта. Приведенная на Рис.30 схема иллюстрирует биотехнологический процесс.

Рассмотрим отдельные стадии биотехнологического процесса. Предферментационный этап складывается из следующих этапов:

1.Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.

2.Приготовление посевной микробной культуры.

3.Приготовление и стерилизация питательных сред.

4.Подготовка биореактора к посеву.

79

www.mitht.ru/e-library

2.Отделение биомассы (клеток продуцента) методом центрифугирования;

3.Разрушение клеток с выделением телец включения;

4.Очистка рекомбинантного белка.

Тельца включения

Рис.29. Микрофотография клеток Е. coli с тельцами включения.

Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генноинженерный инсулин на основе различных современных модификаций генно-инженерного метода. Из 1000 литров бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина, что равно количеству, получаемому из 1600 кг поджелудочной железы животных. Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организмов диабетиков животным инсулином.

Производство и продажу инсулина впервые начала американская фирма Eli Lilly (США). Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 5000 кг.

5. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

В биотехнологии биологические объекты (продуценты) выращивают в условиях, оптимальных для биосинтеза целевых продуктов – культивируют. На первом

78

бактериальная клетка лизирует и продуцирует новые фаговые частицы. В ходе лизогенизации бактериальные клетки могут дополнительно приобретать новые признаки, детерминируемые геномом вируса. Такое явление – изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага — называется фаговой, или лизогенной, конверсией (проявление вирус-индуцироанной трансформации).

Исключение фаговой ДНК из бактериальной хромосомы под действием, например мутагенов, приводит к переходу в литический цикл и репродукции фаговых частиц.

Рис.5. Жизненные циклы умеренного фага (на примере фага E.coli): включение ДНК фага в ДНК хозяина и исключение, приводящее к лизису клетки.

Умеренные фаги, неспособные ни при каких условиях переходить из профага в вегетативный фаг (образовывать зрелые фаговые частицы), называются дефектными, чаще это происходит в результате нарушения

15

www.mitht.ru/e-library

стадии сборки вирусных частиц. Некоторые умеренные фаги называются трансдуцирующими, поскольку с их помощью осуществляется один из механизмов генетической рекомбинации у бактерий – трансдукции. Такие фаги могут использоваться, в частности, в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК и/или приготовлении рекомбинантных (генно-инженерных) вакцин.

Наиболее широко вирусы применяют в вакцинном производстве и в генетической инженерии, где они используются в качестве векторов для внесения чужеродной ДНК, несущей нужный ген, в клетку-хозяина.

Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования больных людей. Однако чаще всего их используют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Лечебное и профилактическое действие фагов основано на их литической активности.

Отличительной чертой бактериофагов как терапевтических средств является почти полное отсутствие

уних побочного действия. В настоящее время

используются	бактериофаги:	сальмонеллезный,
брюшнотифозный,	дизентерийный,		протейный,
синегнойный,	холерный,	стафилококковый,

стрептококковый, коли-фаг (кишечной палочки) и др.

3.3. БАКТЕРИИ

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. Рассмотрение их будет более подробным. Все бактерии делятся на две группы – эубактерии (собственно бактерии) и архебактерии, имеющие по некоторым данным более раннее происхождение, чем эубактерии. Для большинства архебактерий характерна способность расти в экстремальных условиях – при высоких температурах, низких значениях рН,

16

Рис.28. Биосинтез инсулина крысы в сконструированных клетках E. coli: а) карта плазмиды pBR322; б) карта, полученная при определении последовательности рДНК рекомбинантной плазмиды в продуцирующем инсулин клоне E. coli; в) гибридный белок; г) биологически активный инсулин после удаления пенициллиназы и сегмента проинсулина.

Рекомбинантный белок синтезировался бактериями внутриклеточно в виде так называемых телец включения (inclusion bodies), которые представляют собой агрегаты целевого белка в денатурированном неактивном состоянии (Рис.29). Благодаря этому целевой белок, находясь в нерастворимом состоянии, не подвергается протеолизу цитоплазматическими ферментами.

Процесс получения инсулина включал следующие стадии (подробнее см. раздел):

1.Ферментация (выращивание штамма-продуцента в ферментере);

77

www.mitht.ru/e-library

первыми были выбраны бактерии E. coli, которые имеют как преимущества, так и недостатки (Табл.7).

Таблица 7 Преимущества и недостатки Esherichia coli в качестве

системы экспрессии эукариотических генов

Преимущества	Недостатки
Быстрый рост (6-12	Затруднен биосинтез
часов от посева до	крупных полипептидов
окончания индукции)	(>50 кДа)
Относительно высокий	Нет системы
выход целевого белка	гликозилирования
(100-2000 мг/л)
Низкая цена ростовой	Ограниченные
среды (натуральные	возможности секреции
простые компоненты)	белков
Низкая стоимость	Многие гетерологичные
ферментации	белки токсичны для клеток
Возможность получать	Затруднено образование
микрокристаллы	дисульфидных связей
целевого белка (тельца	(важно для восстановления
включения)	третичной структуры
	белка)
	Многие гетерологичные
	белки образуют только
	тельца включения

В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином (Рис.28).

76

концентрированных растворах соли. Ряд биохимических свойств сближает архебактерии с эукариотами, есть у них и уникальные свойства, поэтому архебактерии выделены в отдельную группу.

3.3.1. Таксономия бактерий

Бактерии имеют клеточное строение (Рис.6), размер клеток в среднем 1×5 мкм. В цитоплазме (клеточное пространство, заполненное водным раствором – цитозолем) находится зона нуклеоида, состоящая на 80% из ДНК, 20% приходится на белки и РНК. Наследственная информация в бактериальной клетке содержится в кольцевой молекуле ДНК – единственной хромосоме, которая не окружена мембраной, т.е. ядро отсутствует. В клетках присутствуют небольшие кольцевые молекулы нехромосомной ДНК – плазмиды, несущие необязательную для выживания клетки информацию. Чаще это гены устойчивости к антибиотикам или способности использовать определенные субстраты. Плазмиды реплицируются автономно от хромосомы.

Рис.6. Схема строения бактериальной клетки.

17

www.mitht.ru/e-library

Цитоплазма окружена важнейшей клеточной структурой – цитоплазматической мембраной, представляющей собой двойной слой липидов, в который погружены интегральные белки (в область одного липидного слоя), периферические белки примыкают к поверхности мембраны, трансмембранные белки пронизывают бислой (Рис.7). Функции цитоплазматической мембраны – транспорт питательных веществ внутрь клетки и продуктов метаболизма наружу, а также получение энергии в виде АТФ. Цитоплазматическая мембрана вместе с цитоплазмой называется протопластом.

В цитоплазме находятся рибосомы – комплексы рибосомальной РНК и белка – на рибосомах происходит биосинтез белка на матрице матричной РНК. В клетках бактерии могут присутствовать включения запасных веществ, выросты цитоплазматической мембраны.

Рис.7. Жидко-мозаичная модель строения плазматической мембраны.

Структуры, расположенные снаружи цитоплазматической мембраны, называются поверхностными структурами. К поверхностным структурам относятся клеточная стенка, капсула, чехол, жгутики, ворсинки (Рис.6). Важнейшим компонентом

18

остатка аланина на остаток треонина. В результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 % чистоты. Ограничения использования этого метода связаны с ограниченностью сырьевой базы - поджелудочной железы телят и свиней, поскольку для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 8001000 кг исходного сырья.

Рис.27. Структура инсулина человека: А) структура проинсулина; Б) третичная структура инсулина.

Поскольку известна структура инсулина, можно рассматривать синтетический метод получения инсулина. Синтез обеих цепей, включающий 170 химических реакций, в 1963 г. был реализован в США, ФРГ и Китае. Но перенести такой сложный процесс в промышленность оказалось невозможным.

В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли β-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили рДНК (см. раздел ). Полученную рДНК встроили в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы (см. раздел 4.2.2.1). Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В генетической инженерии в качестве системы экспрессии эукариотических генов используют бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris, линии клеток млекопитающих, трансгенные животные. Исторически

75

www.mitht.ru/e-library

одноцепочечного предшественника — препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С- пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей (Рис.). После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Рис.26. Первичная структура инсулина человека. Первичная структура инсулина у разных

биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека — треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками. Первые лекарственные препараты инсулина были на основе животного инсулина, однако такие препараты вызывали у больных аллергические реакции и другие побочные эффекты. В 1972 г. был разработан метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением

74

стадии сборки вирусных частиц. Некоторые умеренные фаги называются трансдуцирующими, поскольку с их помощью осуществляется один из механизмов генетической рекомбинации у бактерий – трансдукции. Такие фаги могут использоваться, в частности, в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК и/или приготовлении рекомбинантных (генно-инженерных) вакцин.

Наиболее широко вирусы применяют в вакцинном производстве и в генетической инженерии, где они используются в качестве векторов для внесения чужеродной ДНК, несущей нужный ген, в клетку-хозяина.

Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования больных людей. Однако чаще всего их используют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Лечебное и профилактическое действие фагов основано на их литической активности.

Отличительной чертой бактериофагов как терапевтических средств является почти полное отсутствие

уних побочного действия. В настоящее время

используются	бактериофаги:	сальмонеллезный,
брюшнотифозный,	дизентерийный,		протейный,
синегнойный,	холерный,	стафилококковый,

стрептококковый, коли-фаг (кишечной палочки) и др.

3.3. БАКТЕРИИ

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. Рассмотрение их будет более подробным. Все бактерии делятся на две группы – эубактерии (собственно бактерии) и архебактерии, имеющие по некоторым данным более раннее происхождение, чем эубактерии. Для большинства архебактерий характерна способность расти в экстремальных условиях – при высоких температурах, низких значениях рН,

16

www.mitht.ru/e-library

L-аланина, D-глутаминовой кислоты, L-лизина или мезо- (или LL-)диаминопимелиновая кислоты и D-аланина. Диаминокислоты играют важную роль в межмолекулярных сшивках, так как образуют пептидные связи с участием обеих аминогрупп. Тетрапептидные боковые связи всех дисахаридных единиц связаны с соседними цепями при помощи поперечных пентапептидных мостиков из глицина. Таким образом образуется гигантская мешкообразная молекула – муреиновый мешок.

Рис.8. Строение клеточной стенки грамположительных (А) и грамотрицательных бактерий (Б). 1 – цитоплазматическая мембрана, 2 – пептидогликан, 3 – периплазматическое пространство, 4 – наружная мембрана, 5 – цитоплазма (в центре ДНК).

Для быстрой идентификации бактерий используют Определитель бактерий Берги, выпускаемого периодически Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Первое издание Определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.X. Берги (D.H. Bergey, 1860-1937), девятое издание в 4 томах вышло в 1984-1989 гг. Признаки, по которым осуществляется разделение на группы, следующие:

- морфологические (форма клетки (Рис.9), наличие или отсутствие жгутиков, капсулы, способность к

20

несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген tet и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину.

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки

(Рис.25).

Рис.25. Перенос клеток со среды с ампициллином на среду с тетрациклином методом перепечатки.

Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду pBR322. Среди колоний, выросших на среде с ампициллином, выделяют те, которые оказались чувствительны к тетрациклину, и из каждой колонии получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так) объединяют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к тетрациклину, и культивируют их вместе.

4.2.3. Получение рекомбинантного инсулина

Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Дефицит этого гормона в организме приводит к сахарному диабету. Инсулин — небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде

73

www.mitht.ru/e-library