696

б) Отбор по количественному признаку среди мутантов с определенным фенотипом.

Фенотип (от греческого слова phaino - являю, обнаруживаю) - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития. Фенотип складывается в результате взаимодействия наследственных свойств организма (набора генов) – генотипа - и условий среды обитания. Этот метод используется, если известны пути синтеза и регуляции нужного вещества. Наиболее часто рассматривают следующие фенотипические варианты – морфологические изменения, резистентность к структурным аналогам метаболитов, резистентность к антибиотикам, наличие ауксотрофии (ауксотрофия - потеря организмом способности синтезировать те или иные вещества вследствие повреждения генов и появление у такого организма дополнительных питательных потребностей). У мутантов с определенным фенотипом вероятность появления сверхпродуцентов резко возрастает, что уменьшает трудоемкость селекционной работы.

4.2. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры при получении новых пород животных, сортов растений или продуцентов практически ценных микроорганизмов:

1)нельзя скрещивать неродственные виды;

2)нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;

3)нельзя предугадать, какое получится потомство. Молекулярная биология вооружила ученых

пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятными причины ограничений классической селекции, а также то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на

52

крахмала, зерна – их гидролизуют ферметнами (амилазами).

Рис.15. Строение дрожжевой клетки: Кст – клеточная стенка; Мит – митохондрия; Ж – жировая капелька; ПМ – плазматическая мембрана; Яш – ядрышко;

ЭР – эндоплазматический ретикулум; П – гранулы полифосфата.

Д – диктиосомы, одна из форм аппарата Гольджи.

Спиртовое брожение лежит в основе таких промышленных процессов как виноделие, пивоварение, хлебопечение.

Дрожжи богаты белками, их содержание может доходить до 66 %, при этом 10 % массы приходится на незаменимые аминокислоты. Дрожжевая биомасса может быть получена на отходах сельского хозяйства, гидролизатах древесины, её выход не зависит от климатических и погодных условий. Поэтому её использование чрезвычайно выгодно для обогащения белками пищи человека и корма сельскохозяйственных животных.

Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris

успешно применяют в качестве систем экспрессии эукариотических белков в генетической инженерии.

41

www.mitht.ru/e-library

3.4.1.3. Мицелиальные грибы

Важнейшими представителями мицелиальных грибов являются грибы родов Penicillium, Aspergillus и некоторые другие. Плесени продуцируют ферменты, используемые в промышленности (амилазы, пектиназы и другие), органические кислоты лимонную, глюконовую, щавелевую, итаконовую, фумаровую (Aspergillus niger) и антибиотики - пинициллины, цефалоспорины (грибы родов

Penicillium и Cephalosporium). Антибиотик гризеофульвин продуцирует нитчатый гриб Penicillium griseofulvum, антибиотик трихотецин – грибом Trichothecium roseum. Плесневые грибы применяют и в производстве сыров, например, камамбера и рокфора (грибы рода Penicillium),

соевого соуса (Aspergillus oryzae).

3.4.2. Простейшие

Простейшие (Protozoa) – это одноклеточные животные организмы, их рассматривают в курсах зоологии, но благодаря своим микроскопическим размерам они являются объектом микробиологии. Простейшие являются самими многочисленными представителями мира животных и характеризуются чрезвычайным разнообразием форм и поведения. Среди них есть и фотосинтезирующие организмы (эвглена), и хищники, поглощающие за счет фагоцитоза бактерии или других простейших. Некоторые из них быстро плавают в воде, другие – прикрепляются к другим объектам.

Практическое значение простейших связано с тем, что многие из них являются возбудителями болезней человека и животных, например плазмодий малярии, дизентерийная амеба. Для биотехнологии важно, что простейшие являются важнейшим компонентом активного ила (активный ил – естественно возникший биоценоз в аэрируемых очистных сооружениях - аэротенках и биофильтрах). Поглощая большое количество бактерий,

42

2. Подготовка исходного штамма к селекционной работе: ассе исходного штамма на чашки Петри, отбор колоний типичной формы с высокой продукцией целевого вещества.

3. Получение и отбор мутантов.

Мутагенами обрабатывают водные суспензии клеток в буферных растворах при оптимальном значении рН и заданном времени экспозиции. Дозу химического мутагена выбирают, ориентируясь на выживаемость микроорганизмов – отношение количества колоний, выживших после обработки мутагеном к контрольному количеству колоний, в %. Используют дозы, обеспечивающие выживаемость от 0,1 до 5-80%.

4. Отбор мутантов а) Отбор случайных (непредсказуемых) мутаций по

количественному признаку.

После обработки популяции мутагеном проводят тотальный скрининг (проверку) полученных клонов и отбирают наиболее продуктивные. Проводят повторную обработку отобранных клонов, и вновь отбирают продуктивные клоны, то есть проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку. Работа эта требует больших трудозатрат и времени.

При открытии антибиотиков более 60 лет назад этот метод был единственно возможным. Классический пример такой селекции – получение современного продуцента пенициллина Penicillium chrysogenum с применением физических и химических мутагенов. Штамм, выделенный А. Флемигом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц пенициллина в 1 мл культуральной жидкости (КЖ). Воздействие УФ-излучения и алкилирующих агентов позволило в 1960 г. передать в производство штамм, продуцирующий 5000 единиц и более в 1 мл КЖ. Сейчас используют штаммы с продукцией более десятков тысяч единиц/мл.

51

www.mitht.ru/e-library

2)повышение уровня синтеза и активности ферментов, участвующих в синтезе продукта; 3)блокирование синтеза побочных продуктов;

4)блокирование дальнейшего превращения продукта; 5)обеспечение экскреции (выделения) продукта из клетки.

Чаще требуется сочетание нескольких мутаций для сверхсинтеза продукта.

Мутации могут быть неконтролируемыми (спонтанными) и контролируемыми (индуцируемыми). Ограничения метода селекции связано с низкой частотой спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Ген должен удвоиться в среднем 106–108, чтобы возникала мутация. К существенному ускорению процесса селекции ведет индуцированный мутагенез (увеличение частоты мутаций биологического объекта при искусственном повреждении генома в десятки и тысячи раз). Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, ультразвук, ряд химических соединений. К последним относятся окислители, способствующие окислительному дезаминированию азотистых оснований (азотистая кислота, гидроксиламин, перекись водорода), азотистые основания, ингибирующие синтез нуклеиновых кислот и приводящие к ошибкам включения (2-аминопурин, 5-бромурацил, 5-аминоурацил), алкилирующие агенты (металлоорганические соединения, формальдегид, этиленимин, диметилсульфат, нитрозогуанидин, нитрозоэтилмочевина). Применяют и биологические мутагены – вирусы, биотоксины.

Основные этапы селекции

1. Выбор исходного штамма для селекции Выбирают природные продуценты нужных веществ

или микроорганизмы, не продуцирующие нужные вещества, но обладающие другими ценными свойствами.

50

простейшие способствуют выходу бактериальных экзоферментов, концентрирующихся в слизистой оболочке и тем самым принимать участие в деструкции загрязнений. В активных илах встречаются представители четырех классов простейших: саркодовые (Sarcodina), жгутиковые инфузории (Mastigophora), реснитчатые инфузории

(Ciliata), сосущие инфузории (Suctoria).

Показателем качества активного ила является коэффициент протозойности, который отражает соотношение количества клеток простейших микроорганизмов к количеству бактериальных клеток. В высококачественном иле на 1 миллион бактериальных клеток должно приходиться 10-15 клеток простейших.

Простейшие обладают разнообразными биосинтетическими возможностями и потому широко распространенными в природе. Использование простейших в этом направлении уже началось.

3.4.3. Растения

Растения (царство Plantae) как объект биотехнологии рассматривает раздел биотехнологии – фитобиотехнология. В отличие от растениеводства – отрасли сельского хозяйства, фитобиотехнология оперирует с клетками и тканями растений, а также с биологически активными молекулами растительного происхождения. Интересно, что в культуре растительные клетки являются хемогетеротрофами.

Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Для культивирования используют клетки каллуса – неорганизованной массы дифференцированных растительных клеток.

43

www.mitht.ru/e-library

Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Скорость размножения растительных клеток невелика – время удвоения их числа равно 1-3 суткам, тогда как время удвоения бактерий или дрожжей обычно 20-30 мин. Многие из них являются практически, экономически важными продуктами и используются в фармакологической, косметической, пищевой промышленности (алкалоиды кодеин, хинин, атропин, винкристин, сердечный гликозид дигоксин, стероид диосгенин и другие). В настоящее время собрана большая коллекция клеточных культур растений из различных семейств, синтезирующие вторичные метаболиты, широко используемые в промышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный – источник диосгенина, диоскорея дельтовидная – стероидные гликозиды, равольфия змеиная – продуцент антиаритмического алкалоида аймалина и т.д.

Прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в 50 литровом ферментере увеличивается на 2,0 г в литре среды за сутки, что в 1000 раз больше, чем выращивании на плантации. Учитывая высокую стоимость женьшеня (килограмм плантационного корня стоит 100-150 дол. США; цена дикорастущего корня может доходить до нескольких тысяч долларов США) биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма привлекателен.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

44

Для того чтобы извлечь из потенциала микроорганизмов все наиболее ценное, используют методы воздействия на геном, существенно расширяющие их производственные возможности – селекцию и мутагенез, а также генетическую инженерию.

4.1. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ СЕЛЕКЦИИ

Традиционно для получения более активных биологических агентов – продуцентов - применяли селекцию и мутагенез. Селекция – это направленный отбор мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции – это путь от слепого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и др. микроорганизмов.

Для изменения природных способностей микроорганизмов используют изменения генотипа - мутации, приводящие к усилению природных способностей микроорганизмов синтезировать и продуцировать нужные вещества, а также синтезировать вещество в избытке – сверх своих потребностей и продуцировать его. Мутации, способствующие сверхсинтезу продукта, могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих ферменты всех этапов синтеза, транспорта и катаболизма данного продукта, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявиться в следующих основных изменениях метаболизма клеток:

1)повышение скорости поглощения и утилизации субстрата;

49

www.mitht.ru/e-library

4. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

При создании промышленных штаммовпродуцентов, пригодных к использованию в биотехнологических процессах, возможны разные подходы. Классический подход заключается в выделении нужного микроорганизма из природной среды. Из естественных мест обитания предполагаемого продуцента отбирают образцы материала и производят посев в элективную среду, обеспечивающую преимущественное развитие интересующего микроорганизма, т. е. получают так называемые накопительные культуры. Следующим этапом является выделение чистой культуры, то есть содержащей микроорганизмы одного вида, с дальнейшим дифференциально-диагностическим изучением изолированного микроорганизма и определением его способности продуцировать нужный продукт. Существует и другой путь подбора микроорганизмов-продуцентов. Это выбор нужного вида из имеющихся коллекций хорошо изученных и досконально охарактеризованных микроорганизмов. Главным критерием при выборе биотехнологического объекта является способность синтезировать целевой продукт и, главное, - уровень продукции. Однако помимо этого, в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые являются очень важными. Микроорганизмы должны: обладать высокой скоростью роста; утилизировать необходимые для их жизнедеятельности доступные субстраты; быть резистентными к посторонней микрофлоре. Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого продукта. Однако такие продуценты («дикие» штаммы), как правило, не обладают способностью к сверхпродукции, которая делает производство прибыльным.

48

1.Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

-традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

-культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации).

2.Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3.Получение безвирусных растений.

4.Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

5.Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

3.4.4. Животные

То, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, стало понятно в начале XX века, когда смогли получить и поддерживать первые клеточные культуры.

Изначально культуры клеток животных применяли для выращивания и репродукции в таких клетках вирусов. Есть вирусы, которые можно размножать в эмбрионах куриного яйца, но их спектр очень невелик. Совершенствование методик культивирования клеток животных позволило использовать их для накопления больших количеств вирусного материала с целью производства из него вакцин. Сейчас же стало возможным

45

www.mitht.ru/e-library

вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию, а также подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получают из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости одинаковы. Первое – дает возможность получения трансгенных клеток, тканей или организмов, второе – незаменимо для получения моноклональных антител.

Культуры опухолевых клеток или нормальные клетки, трансформированные in vitro, сохраняют в ряде случаев способность синтезировать специфические продукты. Несмотря на много, пока не преодоленных трудностей, показана возможность получения ряда веществ в культуре животных клеток (Табл.5).

Таблица 5 Получение биотехнологических продуктов в культуре

животных клеток

Продукт	Клетки или их источник
Гормон роста	Опухоль гипофиза
Коллаген	Фибробласты
Кортикостероиды	Опухоль надпочечника
Гистамин	Опухоль из тучных клеток
Меланин	Меланома радужной
	оболочки сетчатки
Мукополисахариды	Фибробласты
Фактор роста нервной ткани	Нейробластома

Наиболее перспективным направлением клеточной инженерии является гибридомная технология. Гибридные клетки (гибридомы) образуются в результате слияния клеток с различными генетическими программами, например, нормальных дифференцированных и трансформированных клеток. Блестящим примером достижения данной технологии являются гибридомы, полученные в результате слияния нормальных лимфоцитов

46

и миеломных клеток. Эти гибридные клетки обладают способностью к синтезу специфических антител, а также к неограниченному росту в процессе культивирования.

В отличие от традиционной техники получения антител, гибридомная техника впервые позволила получить моноклональные антитела (антитела, продуцируемые потомками одной единственной клетки). Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одной антигенной детерминанты.

Основные этапы гибридомной техники следующие. Мышей иммунизируют антигеном, после этого из селезенки выделяют спленоциты, которые в присутствии полиэтиленгликоля сливают с дефектными опухолевыми клетками (обычно дефектными по ферментам запасного пути биосинтеза нуклеотидов – гипоксантина или тиамина). Далее на селективной среде, позволяющей размножаться только гибридным клеткам, проводят их отбор. Питательную среду с растущими гибридомами тестируют на присутствие антител. Положительные культуры отбирают и клонируют. Клоны инъецируют животным с целью образования опухоли, продуцирующей антитела, либо наращивают их в культуре. Асцитная жидкость мыши может содержать до 10–30 мг/мл моноклональных антител.

Гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, и в любое время вводить дозу такого клона в животное той линии, от которой получены клетки для слияния. В настоящее время созданы банки моноклональных антител. Антитела применяют в разнообразных диагностических и терапевтических целях, включая противораковое лечение. Таким образом, клеточная инженерия является эффективным способом модификации биологических объектов и позволяет получать новые ценные продуценты на органном и также клеточном и тканевом уровнях.

47

www.mitht.ru/e-library