696

Метод микроинъекции используют в случаях механического введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные микроиглы с диаметром отверстия 0,1-0,5 мкм. В некоторых случаях применяют упаковку рекомбинантной ДНК в липосомы (полые частицы, содержимое которых ограничено липидной мембраной). Заключенные в липосомы ДНК защищены от нуклеаз, легко проникают в клетки в результате слияния липосом и мембраны клеток или при поглощении их путем фагоцитоза.

Электропорация – перенос генетического материала через мембранные поры, образующиеся в результате воздействия на клетку высоковольтного импульса (350 В, 54 мс).

Для трансформации растительных клеток используют бомбардировку микрочастицами золота или вольфрама с адсорбированным на них генетическим материалом. Частицам сообщается кинетическая энергия, достаточная для прохождения через клеточные стенки.

4.2.2.4. Идентификация и отбор клеток, которые приобрели нужный ген

В системе pBR322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт BamHI (в гене tet, см. Рис.18), специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых присутствует интактный ген bla - или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене tet плазмиды pBR322, встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Таким образом, клетки,

72

спорообразованию, особенности внутриклеточного строения, окрашивание по Граму);

-культуральные (признаки, выявляемые при культивировании в лаборатории чистой культуры бактерии);

-физиолого-биохимические (способы получения энергии, потребности в питательных веществах, отношение к факторам внешней среды, нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, наличие и характер минорных оснований в ДНК, нуклеотидный состав рибосомальной РНК, последовательность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями).

Рис.9. Формы бактерий.

А – микрококки, б – стрептококки, в – сарцины, г – диплококки и тетракокки, д – стафилококки, е – палочки, ж

–спороносные палочки.

Вдевятом издании Определителя бактерий Берги все обнаруженные организмы, отнесенные к царству бактерий, разделены на 35 групп, относящихся к 4 секциям

–1) Грамотрицательные бактерии, имеющие клеточную стенку (Gracilicutes); 2) Грамположительные бактерии, имеющие клеточную стенку (Firmicutes); 3) Эубактерии, не

21

www.mitht.ru/e-library

имеющие клеточной стенки (Tenericutes); 4) Архебактерии

(Mendosicutes).

Представленная в Определителе бактерий Берги система классификации является строго идентификационной и не решает задачи выявления эволюционных связей между прокариотами. Для установления степени родства между прокариотными организмами разработаны методические подходы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции. Общепринятой мерой эволюционного расстояния между организмами служит количество нуклеотидных замен в молекулах сравниваемых рРНК. Наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины: 16S (у прокариот) и 18S (у эукариот), состоящих из 1600 и 2500 нуклеотидов соответственно. Как показал анализ нуклеотидного состава 16S рРНК, эволюция живых организмов протекала от прокариот к эукариотам, причем эубактерии и архебактерии – отдельные ветви эволюции

(Рис.10).

3.3.2. Генетическая изменчивость бактерий

Бактерии размножаются бинарным делением, которому предшествует репликация (удвоение) бактериальной хромосомы. В результате образуются две одинаковые дочерние клетки. При этом дочерние клетки являются полными копиями родительской клетки. Как же осуществляется процесс эволюции у бактерий, ведь меняющиеся условия среды диктуют необходимость изменений и адаптации для сохранения жизнеспособности. Такие изменения могут быть результатом мутаций (мутация – стойкое (то есть такое, которое может быть унаследовано потомками данной клетки или организма) изменение генотипа, происходящие под влиянием внешней или внутренней среды.

22

рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной клетке и индуцирует в ней синтез белка.

Для клонирования ДНК используют так называемые пермиссивные клетки (от англ. Permission – разрешение). Особенности пермиссивных клеток:

1.Внутриклеточные нуклеазы не разрушают включаемую ДНК или РНК.

2.Вектор способен реплицироваться в пермиссивной клетке.

3.Выраженная активность промотора и/или терминатора транскрипции рДНК.

4.Сплайсинг РНК.

5.Наблюдается эффективная трансляция мРНК.

6.Нет выраженной активности пептидогидролаз, катализирующих гидролиз экспрессируемых чужеродных белков.

Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются методами трансформации, инфекции, микроинъекций, электропорации. Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией. Для ее осуществления используют специально разработанные приемы, например, обрабатывают клетки бактерий полиэтиленгликолем или хлористым кальцием на холоду. Обработанные таким образом клетки бактерий, подготовленные к трансформации, называются компетентными. Однако эффективность трансформации все же остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки из тысячи. Таким образом, большинство клеток после проведения трансформации не содержат рекомбинантной ДНК.

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последовательностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией.

71

www.mitht.ru/e-library

комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНКлигазой фага Т4 в присутствии АТФ, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты донорной ДНК и исходные плазмидные ДНК (Рис.24).

Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены осуществляют уже после клонировании в клетках E. coli.

Рис.24. Схема встраивания клонируемых фрагментов ДНК в плазмиду pBR322.

4.2.2.3. Введение рекомбинантной ДНК в организмреципиент

Гибридную плазмиду вводят в E. coli, которая при размножении образует клон, все клетки которого содержат

Рис.10. Классификация организмов по нуклеотидному составу 16S рРНК.

Процесс возникновения мутаций получил название мутагенеза). Передача генетического материала между бактериями может происходить в результате конъюгации, трансформации и трансдукции (Рис.11).

Конъюгация – направленный перенос генетического материала путем прямого контакта между клетками. ДНК переносится из клетки донора в клетку реципиента через ворсинки F-пили. Биологическая значимость этого процесса стала проясняться после внедрения в медицинскую практику антибиотиков. Устойчивость к антибиотикам можно получить в результате мутации, что происходит один раз на каждые 106 клеточных делений. Однако, однажды изменившись, генетическая информация может быстро распространяться среди сходных бактерий благодаря конъюгации, поскольку каждая третья из

70

23

www.mitht.ru/e-library

близкородственных бактерий способна именно к этому типу генетического переноса. Для реализации процесса необходим F-фактор – плазмида, кодирующая информацию, необходимую для конъюгации.

Рис.11. Механизмы переноса бактериальной ДНК. Конъюгация (А), трансформация с использованием отдельной молекулы ДНК (Б), трансдукция с помощью фагов (В).

Конъюгация требует наличия двух типов клеток: доноров (F+), обладающих F-фактором, и реципиентов (F-), не обладающих им. При скрещивании клеток F- и F+ фактор фертильности передаётся с частотой, близкой к

100%.

24

Рис.23. Схема получения из мРНК фрагмента ДНК, пригодного для клонирования.

Этот метод является в настоящее время наиболее распространенным методом получения эукариотических генов для экспрессии их в клетках прокариот.

4.2.2.2. Встраивание полученного гена в вектор

Рассмотрим процесс получения бактериального штамма, способного к экспрессии чужеродного (например, эукариотичекого) гена. Если очищенную кольцевую плазмиду pBR322 обработать рестриктазой BamH1, расщепляющей ее в единственном сайте, расположенном в гене устойчивости тетрациклину, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорной (чужеродной) ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно

69

www.mitht.ru/e-library

нуклеотидов, обычно 8–16-звенных, которые затем с помощью ферментов нуклеинового обмена (ДНК-лигаза, ДНК-полимеразы и др.) превращаются в двухцепочечные фрагменты ДНК. В настоящее время такой синтез осуществляют в автоматических синтезаторах олигонуклеотидов по заданной программе.

Ферментативный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК).

Наиболее актуальным в биотехнологии является получение эукариотических белков, таких как инсулин, интерфероны, соматотропин, с использованием прокариотических продуцентов, растущих быстро и использующих доступные субстраты. Проблема экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот заключается в сложном строении эукариотических генов, которые содержат участки, кодирующие белки (экзоны) и интроны – неинформативные участки, вырезаемые после транскрипции в процессе сплайсинга РНК. Поскольку у прокариот механизм сплайсинга отсутствует, для получения нужного гена используют мРНК, содержащую только информативные участки. Схема получения из мРНК фрагмента ДНК, пригодного для клонирования, представлена на Рис.23.

Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью

обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНКполимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.

68

Фактор переноса содержит гены специальных и необходимых при конъюгации структур — F-пилей и ряд других генов, вовлечённых в процесс взаимодействия с F– клетками.

Первый этап конъюгации — прикрепление клеткидонора к реципиенту с помощью F-пилей. Затем между клетками формируется конъюгационный мостик, через который передаётся F-фактор, а также и другие плазмиды, автономно пребывающие в цитоплазме донора. При попадании F-фактора в реципиентную клетку она становится F+ и приобретает способность передавать фактор фертильности другим F–клеткам. Подобный механизм обеспечивает приобретение популяционной устойчивости к антибактериальным агентам.

Трансформация – передача генов при помощи свободной растворимой ДНК, выделенной из клетокдоноров. Клетки поглощают любую ДНК, но включаться в геном может только ДНК, содержащая последовательности, гомологичные последователям ДНК реципиента. Погибшие бактерии постоянно высвобождают ДНК, которая может быть воспринята другими бактериями. Как правило, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется эндонуклеазами, но при некоторых условиях такая ДНК может быть включена в геном бактерии. По происхождению ДНК может быть плазмидной либо хромосомной и нести гены, «трансформирующие» реципиента. Подобным путём в популяции могут быть распространены гены, кодирующие факторы вирулентности. В обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль.

Стадии трансформации бактерии.

Трансформация протекает в три стадии:

1) адсорбция двуцепочечной ДНК на участках клеточной стенки компетентных клеток;

25

www.mitht.ru/e-library

2)ферментативное расщепление связавшейся ДНК в

некоторых случайно расположенных местах с образованием фрагментов 4-5*106 D;

3)проникновение фрагментов ДНК с молекулярной массой не менее 5*106 D, сопровождающееся разрушением одной из цепей ДНК (последний этап энергозависим). Проникшая цепь ДНК рекомбинирует с генетическим материалом реципиентной клетки.

Трансдукция – передача участков бактериальной ДНК от клетки-донора клетке реципиенту при участии бактериофагов. В клетке, инфицированной бактериофагом,

входе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов вместе с вирусной ДНК могут проникнуть фрагменты бактериальной ДНК или плазмиды. Вирусы ограничены в объёме генетического материала в соответствии с объёмом головки. Если ДНК бактериальной клетки расщепляется фагом в нетипичном месте, то чтобы освободить пространство для фрагмента хромосомной ДНК, некоторые участки вирусных ДНК «приносятся в жертву», что приводит к утере определённых их функций. При этом фаговая частица может стать дефектной. Количество аномальных фагов может достигать 0,3% всей дочерней популяции. Образовавшийся фаг и есть частица, вызывающая неспецифическую (общую) трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены.

3.3.3. Рост бактерий

Для интенсивного роста бактериям необходимы определенные условия: необходимые питательные вещества в соответствии с типом питания в водном растворе, температура, рН среды, кислород воздуха (для аэробных бактерий). Если внести бактерии в питательную среду и создать необходимые условия, они будут расти до тех пор, пока не исчерпаются питательные вещества или образуются ингибирующие рост продукты. Рост клеток без

26

Рис.22. Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках.

Химико-ферментативный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного соединения

67

www.mitht.ru/e-library

2.Встраивание полученного гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор), например, получение рекомбинантной плазмиды;

3.Введение гена в составе вектора (например, рекомбинантной плазмиды) в организм-реципиент, например в клетки E.coli;

4.Клонирование в E.coli фрагмента ДНК;

5.Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены.

6.Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки, изменяя их генотип и фенотип.

4.2.2.1.Получение генов, кодирующих целевые белки

Получение генов для экспрессии в клетках

прокариот и эукариот возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментативным синтезом или ферментативным синтезом на основе выделенной матричной РНК (мРНК).

Выделение нужных генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать рестриктазы для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.

Для соединения фрагментов ДНК используют также линкеры и адапторы. Линкер – это синтетический короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания ряда рестриктаз. Он может быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью рестриктазы. Например, линкер EcoR1 представляет собой d 5’(ГГААТТЦЦ)3’. Адаптор – это линкер, содержащий больше, чем один сайт узнавания рестриктазой, то есть адаптор предназначен для соединения фрагментов с несовместимыми концами.

66

добавок свежей питательной среды и удаления продуктов (кроме воздуха) называют периодической культурой. Зависимость логарифма количества живых клеток от времени называется кривой роста, которая имеет S- образную форму (Рис.12). На кривой роста выделяют несколько фаз., сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания. В лаг-фазе клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов.

Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин, Escherichia coli при 37°С - примерно каждые 20 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у

Nitrosomonas и Nitrobacter – даже 5-10 ч. Концентрация клеток Х экспоненциально зависит от времени (уравнение

1).

…………….(1)

где ХО – начальная концентрация бактерий (клеток/мл или г биомассы/мл); - удельная скорость роста, ч-1; t – время культивирования.

27

www.mitht.ru/e-library

Рис.12. Фазы роста бактерий в периодической культуре I- лаг-фаза, II – логарифмическая фаза, III- фаза замедленного роста, IV – стационарая фаза, V – фаза отмирания. Х – концентрация клеток, 106кл/мл.

Удельная скорость роста – параметр, рассчитываемый как отношение скорости прироста биомассы (клеток бактерий) к концентрации биомассы (уравнение 2) и может быть рассчитана как тангенс угла наклона линеаризованной (экспоненциальной) части

28

реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 т.п.о. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то, что емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев 105-106 колоний на 1 мкг клонируемой ДНК. При такой эффективности упаковки требуется всего лишь 2-4 мкг клонируемой ДНК для получения полной клонотеки большинства эукариотических геномов.

Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для лямбда-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий.

4.2.2. Технология рекомбинантных ДНК (рДНК)

Этапы генетического конструирования in vitro (Рис.22 ): 1. Получение нужного гена;

65

www.mitht.ru/e-library

Векторы космидные и фазмидные

Фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.о. Этого недостаточно для клонирования генов животных и растений, длина которых превышает 35-40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами.

Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos-сайты ДНК фага лямбда. Отсюда происходит название всего типа данных векторов

(cosmid) Рис. .

Рис.21. Космидный вектор для клонирования ДНК.

Наличие cos-сайтов в ДНК является единственным необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. Это означает, что последовательность нуклеотидов лямбда-ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, которая заключает в себе весь фаговый геном (35-45 т.п.о.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине фрагмент чужеродной ДНК и упакована в фаговые частицы. Такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной. Однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно

64

кривой роста (в полулогарифмических координатах,

Рис.11).

………………….(2)

Время генерации td (время между делениями клеток) связано с удельной скоростью роста уравнением (3).

………………….(3)

Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата – при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только изза нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за недостатка 02 или накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе. В стационарной фазе достигается динамическое равновесие между гибнущими и лизирующими клетками и бактериями, сохраняющими жизнеспособность за счет продуктов обмена, выделяющихся в результате лизиса.

Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования.

Фаза отмирания характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.

29

www.mitht.ru/e-library

Наибольшую концентрацию биомассы, достигаемую в стационарной фазе роста, называют выходом или урожаем ( XK ). Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования. Для биотехнолога важно определить время окончания культивирования. Оно зависит от природы и механизма образования целевого продукта. Если целевыми продуктами являются собственно биомасса продуцента, внутриклеточные продукты или внеклеточные продукты, образующиеся параллельно ( актериям) с ростом клеток, наивыгоднейшим (без учета технико-экономических показателей) временем окончания является время, соответствующее максимуму средней

продуктивности по биомассе ( PСР ), приходящееся на

время окончания экспоненциальной фазы и резкого замедления роста. Средняя продуктивность биотехнологического процесса – количество целевого продукта, полученного с единицы объема культуральной жидкости в единицу времени (формула 4).

P		XK XO	………………….(4)
СР		t

Внекоторых случаях при получении вторичных метаболитов, например антибиотиков, образование целевого продукта начинается по окончании роста клеток и достижения стационарной фазы. В этом случае оптимальное время окончания процесса увеличивается и определяется динамикой продуктивности по конкретному продукту, не связанной с продуктивностью по биомассе. Причем выход целевого продукта пропорционален накоплению биомассы.

Взадачи биотехнологии во всех вариантах входит решение следующих основных проблем – сокращения непродуктивной лаг-фазы и продления экспоненциальной

30

В частицы фага можно упаковать 37-52 т.п.н. Учитывая размер «плеч» 15 т.п.н., размер вставки около 15 т.п.н. (Рис.19). Схема клонирования ДНК с использованием фага представлена на Рис.20.

Рис.20. Схема клонирования ДНК с использованием фага в качестве вектора.

63

www.mitht.ru/e-library