Занятие № 5. «Белковый обмен. Биохимическая детоксикация»

Цель занятия: изучить методы количественного определения белков; освоить расчетные методы определения биологической ценности белков; изучить пути обезвреживания токсичных соединений

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Переваривание и всасывание белков. Протеазы пищеварительного тракта. Механизм их активации. Пути использования аминокислот в обмене веществ.

2. Декарбоксилирование и дезаминирование аминокислот. Биологическое значение конечных продуктов этих реакций.

3. Механизм реакций трансаминирования. Биологическая роль данного процесса. Пути преобразования аминокислот в углеводы и жиры

4. Пути образования и обезвреживания аммиака. Чем отличаются уреотелические, урикотелические и аммониетелические животные? Чем объяснить возникновение разных путей выведения аммиака из организма птиц, млекопитающих и рыб?

5. Цикл образования мочевины. Связь орнитинового цикла с циклом лимонной кислоты.

6. Биохимические механизмы образования и обезвреживания скатола и индола.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Количественное определение общего белка в сыворотке крови.

В плазме крови содержится до 200 различных белковых компонентов. Большая часть выполняемой функции крови, так или иначе, связана с белками плазмы: поддержание онкотического давления, участие в процессах свертывания крови, регуляции рН крови, выполнение транспортной и защитной функции, функции «белкового резерва» и др. Качественное и количественное постоянство белкового состава крови четко поддерживается организмом, и любые изменения в этой системе, как правило, являются отражением нарушенного функционирования тех или органов и тканей.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Центрифуга.

4.Центрифужные пробирки.

5. Водяная баня.

6. ФЭК.

7. Кюветы, 10 мм.

Реактивы. 1. Сыворотка крови.

2. Трихлоруксусная кислота, 3%-ный раствор в этаноле.

3. Биуретовый реактив.

4. Хлорид натрия, 0,85%-ный раствор.

1. 0,1 мл сыворотки крови внесите в пробирку, содержащую 2,4 мл 0,85% раствора хлористого натрия.

2. Прибавьте 2,5 мл биуретового реактива.

3. Перемешайте, термостатируйте 30 мин при 37^оС, измерьте оптическую плотность при зеленом светофильтре (540-560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит биуретовый реактив.

К

Калибровочный график для определения белка биуретовым методом.

онцентрацию общего белка определите по калибровочному графику.

Сравните полученные значения с нормальными величинами. О чем свидетельствует снижение (повышение) уровня белка в сыворотке крови у животных? К каким последствия может привести недостаточность белков в крови?

Опыт 2. Белки как противоядие от ионов тяжелых металлов.

Взаимодействие ионов металлов с белками лежит в основе использования молока как противоядия при отравлении тяжелыми металлами.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Водяная баня.

Реактивы. 1. Амилаза, раствор.

2. Крахмал, 1%-ный раствор.

3. Ацетат свинца, 1%-ный раствор.

4. Молоко.

5. Дистиллированная вода.

6. Йод, 1%-ный раствор.

1. В опытную пробирку налейте по 1 мл раствора амилазы, 1%-ного раствора крахмала, 1%-ного раствора ацетата свинца (II) и молока.

2. В контрольную пробирку налейте по 1 мл растворов амилазы, крахмала, ацетата свинца (II) и воды.

3. Пробирки встряхните и выдержите 20 минут при температуре 30°С.

4. Добавьте в обе пробирки по 1 капле 1%-ного раствора йода.

Объясните полученные результаты.

Опыт 3. Определение мочевины в биологических жидкостях.

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

1. В три пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице:

Раствор	Опытная проба, мл	Калибровочная проба, мл	Контрольная проба, мл
Исследуемый образец	0,02	–	–
Реактив 1	–	0,02	–
Дистиллированная вода	–	–	0,02
Реактив 2	4	4	4

2. Пробирки закройте алюминиевой фольгой и поместите на кипящую водяную баню точно на 10 мин.

3. После этого пробирки быстро охладите проточной водой и измерьте оптическую плотность опытной пробы (D₁) и калибровочной (D₂) против контрольного раствора при 580-650 нм (оранжевый или красный светофильтр) в кювете толщиной слоя 10 мм. Измерение следует провести до 15 мин после охлаждения.

4. Рассчитайте концентрацию мочевины по формуле:

где Х  концентрация мочевины в калибровочной пробе.

Сравните полученные значения с нормальными величинами. О чем свидетельствует снижение (повышение) количества мочевины в сыворотке крови у животных?

Опыт 4. Определение индикана в моче.

Количество индикана в моче является постоянной величиной у здоровых животных. Увеличение индикана моче наблюдается при воспалении мышц, обширных травмах и при избытке триптофана в рационе животных.

Определение индикана в моче базируется на гидролизе его соляной кислотой с последующим окислением хлорным железом индоксила и тимола в соединение розово-фиолетового цвета.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Стаканчик.

4. Фильтр.

5. Стеклянная воронка.

Реактивы. 1. Моча.

2. Ацетат свинца, 10%-ный раствор.

3. Хлороформ.

4. Тимол, раствор в 96^о этаноле.

5. Реактив Жолеса (0,5 г хлорида железа (III) в 100 мл концентрированной

соляной кислоты).

1. 20 мл мочи смешайте с 10 мл раствора уксуснокислого свинца. Встряхните. Фильтруйте смесь.

2. К 10 мл фильтрата добавьте 1 мл раствора тимола и 10 мл реактива Жолеса.

3. Через 15 минут в смесь внесите несколько капель хлороформа. Взболтайте и произведите оценку результатов исследования.

В норме отмечают розово-фиолетовое окрашивание хлороформа, интенсивность которого при выраженной диканурии повышается до красно-фиолетового.

Запишите Ваши результаты. Продуктом метаболизма какой аминокислоты является индикан? Напишите структурную формулу индикана.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________