Мозаичные животные и животные-химеры

1. Эмбрион млекопитающих: дифференцировка клеток

Ранний зародыш млекопитающих вплоть до 8 - клеточной стадии обладает поразительной способностью к регуляции развития и каждая из его клеток может образовать в дальнейшем любую из частей более позднего зародыша или даже взрослого организма. Примером тому может служить образование идентичных близнецов из одной оплодотворенной яйцеклетки. В данном случае возникают два вполне нормальных индивидуума, каждый из которых сформирован из части нормального зародыша. Если, например, одну из клеток 2 - клеточного эмбриона мыши разрушить иглой, а оставшийся неполный эмбрион имплантировать в матку для дальнейшего развития, то в большом числе случаев на свет появится вполне нормальная мышь.

Вместе с тем можно объединить два восьмиклеточных эмбриона мыши в одну гигантскуюморулу, которая в результате развития образует мышь нормального размера. Животных, возникающих вследствие развития агрегатов генетически различных клеток, называютхимерами. Химер можно также получать в результате инъекции клеток ранних эмбрионов вбластоцистыиного генотипа. Введенные чужеродные клетки включаются в состав внутренней клеточной массы эмбриона - реципиента и в результате образуется химерное животное. Химер можно получить даже после инъекции одной клетки, это позволяет выяснить, насколько та или иная клетка сохраняет потенции к развитию.

Из результатов подобных экспериментов следует важный вывод: клетки очень ранних эмбрионов млекопитающих (вплоть до 8 - клеточной стадии) идентичны и обладают неограниченными потенциями, т.е. они тотипотентны.

Клетки становятся различными вследствие их взаимодействия друг с другом. У эмбриона мыши первые различия междуклетками внутренней клеточной массыитрофоэктодермыобусловливаются расположением межклеточных контактов. На 8 - клеточной стадии всебластомерызанимают примерно одинаковое положение, их внутренняя поверхность контактирует с другими бластомерами, а внешняя поверхность обращена наружу. Каждый из бластомеров обладает полярностью, характеризуемой присутствием микроворсинок на наружной поверхности и асимметричным расположение внутриклеточных компонентов. Результаты экспериментов на бластомерах in vitro показывают, что такая полярность определяется характером межклеточных контактов: сборка микроворсинок и ассоциированных с ними компонентов осуществляется при условии, что этот участок поверхности не имеет контакта с другими бластомерами. Плоскость следующего деления ориентирована так, чтобы использовать эту асимметрию для создание двух различных потомков, один из которых (клетка внутри клеточной массы) обращен внутрь и лишен компонентов, ассоциированных с микроворсинками, а другой (клетка трофэктодермы) обращен наружу и наследует эти компоненты. Таким образом, расположение межклеточных контактов, вероятно, контролирует возникновение первых различий между клетками

Генетические  мозаики.

С помощью этого метода удается «проследить судьбу измененных мутацией клеток и тканей на всем протяжении эмбриогенеза.

Насекомые. Истинными генетическими  мозаиками считаются животные, клетки которых происходят из одной зиготы, но несут, тем не менее, определенные генетические  различия. Наиболее известным примером таких мозаиков являются гинандроморфные особи, описанные у паразитических осHabrabracon juglandiП. Уайтингом. Гинандроморфы, т.е. особи, имеющие ткани и самца, и самки, очень редко (1 случай из 1000— 10000) выводятся из аномальных яиц с двумя ядрами, из которых бывает оплодотворено только одно. Женские ткани развиваются из диплоидного ядра, а мужские — из неоплодотворенного, гаплоидного. Если ткани, развившиеся из оплодотворенного яйца, имеют четкие морфологические отличия, например измененный цвет глаз или аномальное жилкование крыльев, то легко видеть, что тело гинандроморфной особи представляет собой мозаику из тканей самца и тканей самки (рис.6). Наблюдая за поведением таких ос, Уайтинг показал, что насекомые ведут себя либо как самец, либо как самка в зависимости от того, как распределяются на теле участки "самцовых" и исамочьих" тканей (см.: Эрман, Парсонс, 1984).

Рис. 6 Гинандроморфные особи Habrabracon juglandi. Для нормальной самки (а) характерны более длинные крылья, более короткие антенны и жало с парой сенсорных придатков, у самца (в) крылья короче, чем у самки, а антенны, длиннее, анатомия конца брюшка иная, б — гинандроморфная особь. Справа — голова гинандроморфной особи "в профиль" часть тканей глаза имеют генотип самца (светлые участки), а часть — генотип самки (темный участок)

У дрозофилы мозаичные по тканям самца и самки особи получаются, когда в скрещивание берутся самки с так называемой кольцевой Х-хромосомой. Эта кольцевая структура неустойчива и часто утрачивается в период ранних митотических делений эмбрионов женского пола, которые получили одну кольцевую, а одну нормальнуюХ-хромосомы. Клетка, в которой остается только однаХ-xpoмосома, дифференцируется по мужскому типу (поскольку у дрозофилы особи с генотипомХ0— самцы). Мозаицизм обнаруживается по рецессивным генам, локализованным вХ-хромосоме, а также по тем признакам, развитие которых определяется генетической  программой, свойственной одному или другому полу (рис.7; 8).

Рис 7. Схема получения гинандроморфных особей у дрозофилы (а); б — "карта судьбы": схематическое изображение бластулы дрозофилы, с указанием участков, в дальнейшем развивающихся в соответствующий орган и

Благодаря работам С. Бензера и его коллег, проведенным в 60—70-е годы, в настоящее время имеется достаточно полная картина так называемой "карты судьбы" ("fate map") — топографического расположения на бластуле участков, из которых впоследствии развивается тот или иной орган или часть тела дрозофилы (см.: Бензер, 1975), Основные успехи нейрогенетики и генетики поведения дрозофилы базируются именно на использовании метода гинандроморфных мозаиков.

Рис. 8. Схематическое изображение гинандроморфных особей Ткани самки — темные, самца — светлые, Разное соотношение тканей с разным генотипом связано со случайным процессом — утерей Х-хромосомы на разных стадиях дробления яйца

Млекопитающие.Единственный случай сходного типа мозаицизма у позвоночных описан еще в начале 70-х годов. Это исследование было посвящено мозаичности в проявлении мутацииsh-1мыши, затрагивающей строение кортиева органа. Анализировали фенотип самок мышей, гомозиготных поsh-1и имеющих в гетерозиготном состоянии так называемую транслокацию Каттанаха (транслокация — это хромосомная перестройка, при которой фрагмент одной хромосомы соединяется с другой). При упомянутой транслокации фрагмент 7-й хромосомы с мутантным аллелемsh-1оказался соединенным сХ-хромосомой. Как известно, в каждой из клеток тела самки в активном состоянии находится только однаХ-хромосома, а вторая инактивирована. Поскольку в случае данной транслокации ген sh-1 был соединен с одной изХ-хромосом, а мутация эта рецессивна, то в тех клетках, где была инактивированаХ-хромосома, несущая транслокацию (и генsh-1), эффект мутантного гена не обнаруживался. Если же была инактивированаХ-хромосома, не имевшая транслокации, то оба генаsh-1были активны и проявлялся эффект рецессивной мутации. Фенотипически это выражалось в том, что в кортиевом органе участки мутантных и нормальных клеток перемежались.

Химеры  млекопитающих. Животных с генетически неоднородным организмом можно получать и в специально спланированных эмбриологичеких экспериментах (Мак-Ларен, 1979) — речь идет о химерах . Получение химер  млекопитающих состоит из нескольких этапов. При использовании агрегационного метода извлеченные из половых путей самки эмбрионы на стадии дробления приходят в соприкосновение друг с другом, в результате чего они сливаются в один. С помощью инъекционного метода в бластоцисту эмбриона вводятся клетки другого эмбриона или другие донорские клетки (например, клетки определенной опухоли, клетки костного мозга и т.д.). На следующем этапе химерный эмбрион переносят в матку приемной матери.

Для распознавания отдельных компонентов химерного организма необходимо, чтобы ткани разного происхождения имели четкие и простые маркеры. Таким маркером может быть особенность пигментации, наличие редких форм изозимов, антигены, хромосомные транслокации и т.п.

Получение химерных животных в настоящее время налажено во многих лабораториях. Проблема подбора адекватных маркеров (морфологических — цвет шерсти, или биохимических — изоферменты) для анализа "происхождения" того или иного участка мозга химерного животного, как правило, бывает достаточно трудной. Для такого маркирования используются, например, межлинейные генетические  различия в локусе структурного гена бета-галактозидазы. Этот фермент обнаруживается цитохимически в крупных нейронах. Нередко используют также антигенные различия в генопродуктах разных аллелей гена глюкозофосфатизомеразы.

Большинство неврологических мутаций мыши (это, как правило, аномалии строения мозжечка и/или внутреннего уха) рецессивны, т.е. их эффект проявляется в гомозиготном состоянии, а гетерозиготные особи практически не отличаются от нормы. В то же время особи, гомозиготные по этим мутациям, имеют резко сниженную жизнеспособность и поэтому трудны для изучения. Получение мышей- химер , составленных из нормальных и мутантных тканей, позволяет изучать мозг, мозаичный по генетическому  составу. При удачном подборе маркеров можно увидеть, что даже рядом расположенные нейроны одного класса (например, клетки Пуркинье) имеют разный генотип. Как правило, неврологический дефект у таких химерных мышей не проявляется, однако на нейроанатомическом уровне можно установить, какой именно тип клеток несет первичный дефект мутации, а какие клетки страдают вследствие нарушений нормальных эпигенетических отношений с первично аномальными. Анализ особенностей поведения мышей- химер  также представляет интерес для выяснения роли генотипа в определении особенностей той или иной реакции. С мутацией Lurcher, например, были проведены эксперименты, показавшие, что у гетерозигот LC1+ сильно нарушена локомоция, тогда как у мышей- химер , "составленных" из эмбрионов, гомозиготных по этой мутации, и нормальных зародышей, таких изменений не было (см. также: Goldowitzetal., 1992).

На серийных срезах мозга, например на срезах ствола и мозжечка химерных мышей, у которых нормальные и мутантные нейроны различаются визуально, можно определить общее количество нейронов в моторном ядре лицевого нерва, а также число клеток Пуркинье мозжечка с нормальным и мутантным фенотипами. Статистические оценки позволили заключить, что родоначальниками клеток Пуркинье в мозге мыши являются 8 клеток, а нейроны ядра лицевого нерва происходят от 12 клеток-предшественниц.

У мышей известны межлинейные различия по числу нейронов той или иной структуры мозга. Есть веские основания предполагать, что одной из причин этой изменчивости могут быть различия в числе клонов, формирующих данный участок мозга, т.е. в числе "клеток-родоначальниц" и/или в размере клона, т.е. в числе митотических делений исходной клетки перед началом дифференцировки.

Нейрохимические, морфологические и физиологические различия между инбредными линиями мышей, описанные к настоящему времени, несомненно, определяются значительным числом локусов. Современные методы генетического  анализа, использующие множественные маркеры, а также конгенные и рекомбинантные линии (в частности, метод картирования QTL — quantitative trait loci), позволяют описывать такие межлинейные различия. Возможно, они помогут и в описании структурных различий в мозге, которые являются ключевыми в возникновении межлинейных различий в поведении.

Феномен черепаховых котов

Мозаика– (1)наличие разноцветного окраса, т.е. пятнистого или черепахового; (2) - животное-носитель генетически различных хромосом, например XY/XXY; (3) – животное - носитель соматического мозаицизма.Соматический мозаицизм- наличие генетически различных групп клеток в организме, возникших в результате мутации/повреждения ДНК или отклонения в хромосомах.Эмбриональный мозаицизм- специфическая мутация на ранней стадии развития эмбриона, обусловливающая в дальнейшем тот факт, что яйцеклетка или сперматозоид будет нести видоизмененный ген, который может быть передан потомству. Обнаруживается только в потомках, наследующих мутацию.

Отдельный организм может иметь больше, чем одну форму проявление мозаицизма. Доля клеток каждого гентоипа весьма переменна и отражает, по сути, на какой стадии развития эмбриона возник мозаицизм. Несмотря на то, что мозаики и химеры имеют более одной группы генетически различных клеток и внешнее проявление этого может быть одинаковым, существует четкая разница между мозаицизмом и химерами. У мозаик генетически различные типы клеток возникли на основе одного эмбриона, тогда как химеры обязаны своему появлению слиянию двух и более эмбрионов. Рыжий окрас у кошек (известный также как «оранжевый» или «красный») обусловлен так называемым геном «О». Ген О видоизменяет черный пигмент шерсти на красный и локализован на Х хромосоме. Нормальный кот с XY хромосомным набором должен унаследовать только один ген О, чтобы быть красным. У нормальной кошки хромосомный набор выглядит как ХХ. Она должна унаследовать два гена О, чтобы быть красной. Если наследуется только один ген – кошка будет черепаховой, если ни одного – черной. Соответственно, кот не может иметь черепаховый окрас. Однако, известно достаточно случаев наличия черепахового окраса у котов, что в большинстве случаев сочеталось с бесплодием.

Почти все самки млекопитающих являются мозаиками, т.е. представляют собой смесь двух генетически различных типов клеток, хотя внешне это может никак не проявляться. Самки наследуют две Х хромосомы, тогда как самцы – одну Х и одну Y (ген, расположенный на Y хромосоме превращает эмбрион в самца). Тогда как другие хромосомы должны наследоваться парами, самцы отлично обходятся всего одной Х хромосомой. Отсюда вывод – наличие двух Х хромосом может обусловливать определенного вида генетические аномалии (слишком много генов), но у самок эта проблема решается путем инактивации той или иной Х хромосомы. Давно известно, что клетки самок млекопитающих содержат нечто под названием "Barr body", и что черепахового окраса почти всегда оказываются самки. В 1960-х годах генетик Mary Lyon предположила, что самки «выключают» одну Х хромосому в каждой клетке своего тела, а «Barr body» является своего рода «выключателем». На очень ранней стадии развития эмбриона в каждой клетке происходит инактивация одной Х хромосомы в случайном порядке. Каждая из клеток в конечном итоге порождает группу клеток с точно такой же инактивированной Х хромосомой.

Случайная инактивация означает, что самки, по сути, состоят из смеси клеток двух различных типов. Некоторые участки ее тела состоят из клеток, использующих Х хромосому, полученную от матери, а другие – от отца. Она – мозаика, состоящая из клеток двух популяций. Хотя Х хромосома несет только около 5% генетической информации, эти группы клеток могут быть весьма и весьма различны в генетическом плане! У кошек это проявляется в виде черепахового окраса – одна Х хромосома порождает красный окрас шерсти, а другая – черный. Схожий эффект можно наблюдать у женщин с Anhidrotic Ectodermal Dysplasia (приводящей к уменьшению в коже числа клеток, выделяющих пот). Если только одна Х хромосома несет поврежденный ген, то кожа получится мозаичной, состоящей из маленьких участков с или без клеток, способных выделять пот. Согласно ведущему специалисту в области генетики кошек Roy Robinson, существует три причины, приводящих к появлению черепаховых котов: соматическая мутация (иногда называемая мозаицизм), синдром  Klinefelter и химеры. Соматическая мутация обусловливает наличие у красных котов маленьких черных пятен, сходных с родинками у человека. Иногда эти пятна могут быть достаточно большими, чтобы придать коту подобие черепахового окраса. Размер черных пятен может зависеть от этапа развития эмбриона, на котором произошла мутация. Если это случилось на поздней стадии - получим пятнышко или веснушку. Если мутация протекала на ранней стадии эмбрионального развития - получим большое пятно, потому что мутировавшие клетки будут продолжать делиться и умножаться в количестве по мере роста эмбриона. Соматические мутации редко замечают у кошек, для которых черепаховый окрас является обычным, только лишь в случае появления черепаховых кошек в пометах, где от родителей генетически не могут родиться черепахи или кошки с черным. У красных кошек с большим количеством белого появление даже небольшого черного пятнышка может навести на мысль о калико окрасе. Другая причина появления черепаховых котов заключается в неправильном генетическом наборе (ХХY, синдром Klinefelter), но только одна из Х хромосом несет ген О. Х хромосомы случайным образом инактивируются, так же как у кошек. Подобные коты обычно бесплодны, и их ткани представлены смесью клеток, содержащих XX и XY, XX и XXY, или XY и XXY хромосомы. Если клетки "нормальной" ткани с XY хромосомами слагают половые органы, то кот может оказаться репродуктивным, хотя окрасы котят будут зависеть от того, несет ли Х хромосома тканей яичек ген О или нет. Синдром Klinefelter встречается у различных видов животных, в том числе кошачьих, сообщалось, например, об амурском тигре с набором XXY хромосом. Возможно даже слияние двух оплодотворенных яйцеклеток. Если обе яйцеклетки (эмбрионы) содержат XY хромосомы, в результате может получиться кот с XY/XY хромосомным набором - химера. У таких химер, если одна Х хромосома несет ген О, а другая - нет, в окрасе может встречаться и красный, и черный цвет шерсти, потому что различные участки кожи будут слагаться из клеток двух разных эмбрионов. Также это может быть мозаика других цветов, например, черного и серого окрасов. Химера с XY/XY хромосомным набором может быть репродуктивной особью. Если же мужской эмбрион сольется с женским, мы получим химеру с XX/XY хромосомным набором, при этом отдельные ткани организма будут генетически женскими, а другие - мужскими. В химере такого рода  обязательно произойдет инактивация одной Х хромосомы. Три Х хромосомы могут нести гены различных окрасов (особенно если мать вязалась подряд с разными котами). Физические особенности и сексуальное поведение  XX/XY химер зависит от того, из каких клеток состоят те или иные органы кота. Очень редко черепаховый кот вообще не является котом. Генетически это кошка, у которой в силу гормональных проблем в период эмбрионального роста развились характерные черты кота. Этим можно объяснить женское поведение отдельных черепаховых котов - генетически они кошки с внешними мужскими признаками. Соматический мозаицизм и химеры связаны не только с красными или красными с белым окрасами, просто мы скорее замечаем необычных черепаховых котов, не обращая внимания на тот факт, что и черепаховые кошки могут быть результатом генетических мутаций.

Заключение

Широкие возможности глубже понять роль генов в дифференцировке клеток и в регуляции взаимодействий между клетками в процессе развития дают химерные и трансгенные животные. Развитие экспериментальных методов в последнее время сделало возможным получать совершенно необычных животных, которые несут гены не только одного отца и одной матери, но и большего количества предков.

Химерные животные – это генетические мозаики, образующиеся в результате объединения бластомеров от эмбрионов с разными генотипами. Получение таких эмбрионов осуществляется во многих лабораториях. Принцип получения химер сводится главным образом к выделению двух или большего числа ранних зародышей и их слиянию. В том случае, когда в генотипе зародышей, использованных для создания химеры есть отличия по ряду характеристик, удается проследить судьбу клеток обоих видов. С помощью химерных мышей был, например, решен вопрос о способе возникновения в ходе развития многоядерных клеток попречнополосатых мышц. Изучение химерных животных позволило решить немало трудных вопросов, и в будущем благодаря применению этого метода появится возможность решать сложные вопросы генетики и эмбриологии.

К примеру, во Франции проводились исследования, чрезвычайно важные для стоматологии: в погоне за химерой птицезуба французы создали буквальную химеру: цыплячий эмбрион с пересаженными клетками, взятыми у мышей. Идея была такова: если клетки зародыша цыплёнка не способны превратится в зубы, то, возможно, мышиные клетки смогут "прочитать и выполнить" генетическую программу. Предполагалось, что сам челюстной эпителий куриного зародыша не утратил способности к зубообразованию, но эта способность блокируется нервной тканью. Для снятия генетической блокировки в клюв эмбриона пересадили мышиные нервные мезенхимальные клетки, и этого оказалось достаточно, чтобы запустить генетический механизм. Вопреки французской народной мудрости, у партии химерических цыплячьих эмбрионов стали формироваться вполне куриные рудиментарные зубки. Это произошло впервые со времён динозавров.

Ряд работ по мозаичности указывает на интимную зависимость функциональной активности нейронов от генетического аппарата.

В 1932 г. Б. Уайтинг обнаружил ненормальное поведение у гинандроморфных ос (Habrobracon juglandis), участки тканей которых представляют собой мозаику из клеток мужского и женского типа. Такие осы ухаживают за личинками мельничной огневки (Ephestia) так же, как самцы ухаживают за самками своего вида. Нормальные же самки жалят личинок мельничных огневок, откладывая в них свои яйца. Некоторые гинандро-морфные осы жалят своих самок так же, как самки жалят мельничных огневок. Эта работа давала основания полагать, что такое "извращенное" поведение гинандроморфных особей обусловливается мозаичным распределением в ганглиях нейронов с различной генетической детерминированностью пола. Последующие исследования, проведенные на дрозофиле, доказали это предположение. Эти исследования давали основание к допущению, как на это справедливо указывал в 1964 г. Е. Каспари, что поведенческие реакции могут контролироваться единичными генами. В конце 1970 г. появились работы С. Икеды и А. Каплана. Их исследования доказывают, что различия в поведенческих реакциях могут контролироваться одним геном. Авторам удалось вывести линии дрозофил, у которых при выходе из эфирного наркоза наблюдалось характерное подергивание лапок. Изучение гинандроморфных (гинандроморфизм - половая аномалия, встречающаяся у насекомых и обус­ловливающая развитие мозаичных особей, у которых одна часть тела мужская, другая – женская) особей показало, что глаза этой особи представляют собой мозаику тканей самца (точки) и самки (заливка). У та­ких морфологически   мозаичных животных  наблюдается "мозаичность" поведения (по Уайтингу, 1932) Таким образом, в настоящее время доказан принципиально важный факт: генетический аппарат нейрона обусловливает особенности его биоэлектрической активности и поведенческих реакций организма.