Вопрос № 7. Биосинтез дезоксирибонуклеотидов

Синтез дезоксирибонуклеотидов идёт с заметной скоростью только в тех клетках, которые вступают в S-фазу клеточного цикла и готовятся к синтезу ДНК и делению. В покоящихся клетках дезоксинуклеотиды практически отсутствуют. Все дезоксинуклеотиды, кроме тимидиловых, образуются из рибонуклеотидов путём прямого восстановления ОН-группы у второго углеродного атома рибозы в составе рибонуклеозиддифосфатов до дезоксирибозы. Тимидиловые нук-леотиды синтезируются из dУМФ особым путём с участием N⁵,N¹⁰-метилен-Н₄-фолата.

А. Рибонуклеотидредуктазный комплекс

Реакцию восстановления НДФ в дезоксипроизводные катализирует рибонуклеотидредук-тазный комплекс, в состав которого входят: собственно рибонуклеотидредуктаза (РНР), белок тиоредоксин и фермент тиоредоксинредуктаза, обеспечивающий регенерацию восстановленной формы тиоредоксина (рис. 10-17).

Рибонуклеотидредуктаза - олигомерный белок, состоящий из двух В₁- и двух В₂-субъединиц, и содержит негеминовое железо в качестве кофактора.

Непосредственным донором водорода в реакции восстановления рибозы служит низкомолекулярный белок тиоредоксин. В рабочую часть этого белка входят 2 SH-группы, которые, отдавая водород, окисляются с образованием дисульфидного мостика. Второй фермент комплекса - тиоредоксинредуктаза - катализирует гидрирование окисленного тиоредоксина с использованием NADPH.

При участии комплекса РНР образуются: dАДФ, dГДФ, dУДФ и dЦДФ, которые с помощью НДФ-киназ превращаются в дНТФ, 3 из которых (кроме дУДФ) непосредственно используются в синтезе ДНК.

дНДФ + АТФ → дНТФ + АДФ.

Б. Биосинтез тимидиловых нуклеотидов

Тимидин-5'-монофосфат (дТМФ) образуется из дУМФ в реакции, катализируемой тимиди-латсинтазой (рис. 10-18). Донором метильной группы, появляющейся в 5-положении пиримидинового кольца в молекуле дТМФ, служит кофермент тимидилатсинтазы - N⁵,N¹⁰-метилен-Н₄-фолат. С помощью этого кофермента в молекулу дУМФ включается метиленовая группа и восстанавливается в метальную, используя 2 атома водорода от Н₄-фолата.

Рис. 10-17. Восстановление рибонуклеозиддифосфатов в 2'-дезоксирибонуклеозиддифосфаты.1 - рибонуклеотидредуктаза (РНР); 2 - тиоредоксинредуктаза.

Образование субстрата тимидилатсинтазной реакции - дУМФ осуществляется двумя путями (рис. 10-19):

• дефосфорилированием дУДФ;

• гидролитическим дезаминированием дЦМФ с помощью дЦМФ дезаминазы. дЦМФ получается при дефосфорилировании дЦДФ - одного из продуктов рибонуклеотидредуктаз-ной реакции. В организме человека это основной путь образования дУМФ.

Скорость синтеза дТМФ зависит также от количества второго субстрата тимидилатсинтазной реакции - N⁵,N¹⁰-метилен-Н₄-фолата, пополнение запасов которого осуществляется при участии 2 ферментов: дигидрофолатредуктазы, которая с участием NADPH восстанавливает Н₂-фолат в Н₄-фолат, и серии гидроксиметилтрансферазы, осуществляющей перенос β-гидроксиметиленовой группы серина на Н₄-фолат (см. раздел 9). У человека дТМФ образуется, главным образом, из дЦДФ.

В. "Запасные" пути синтеза дезоксирибонуклеотидов

В быстроделящихся клетках наряду с синтезом дезоксинуклеотидов с помощью рибонуклеотид-редуктазного комплекса и тимидилатсинтазы активируются реакции, обеспечивающие повторное использование тимина и дезоксицитидина в реакциях, катализируемых ферментами "запасных" путей и обратимых реакций катаболизма. Под влиянием тимидинфосфорилазы протекает следующая реакция:

Тимин + Дезоксирибоза-1-фосфат → Тимидин + Н₃Р0₄.

Рис. 10-18. Синтез дТМФ из дУМФ.

Рис. 10-19. Образование ТТФ из дЦДФ и дУДФ.1 - дЦМФ дезаминаза; 2 -тимидилатсинтаза; 3 - дНМФ- и дНДФ 4 - дигидрофолатредуктаза; 5 - серингидроксиметилтрансфераза.

Тимидинкиназа катализирует следующую реакцию:

Тимидин + АТФ → дТМФ + АДФ.

Дезоксицитидинкиназа катализирует следующую реакцию:

Дезоксицитидин + АТФ → дЦМФ + АДФ.

Г. Регуляция синтеза дезоксирибонуклеотидов

Рибонуклеотидредуктаза, тимидилатсинтаза и тимидинкиназа - индуцируемые ферменты, их количество в клетке регулируется на генетическом уровне по механизму индукции и репрессии. Синтез этих белков начинает нарастать в G₁-периоде, достигает максимума во время активного синтеза ДНК, снижаясь практически до нуля в G₂- и М-периоды клеточного цикла.

В то же время активность РНР подвержена сложной аллостерической регуляции, с помощью которой достигается сбалансированное образование всех дНДФ.

РНР осуществляет последовательное восстановление всех рибонуклеозиддифосфатов. Первыми восстанавливаются шфимидиновые нуклеотиды, а последним - дАДФ. дАДФ фосфорилируется в дАТФ, накопление которого полностью прекращает восстановление всех остальных рибонуклеозиддифосфатов.

Д. Нарушения в работе РНР, вызванные недостаточностью ферментов катаболизма пуриннуклеотидов

Аденозиндезаминаза (АДА) и пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФ) участвуют в превращении пуриновых нуклеозидов в азотистые основания. Их недостаточность сопровождается развитием тяжёлых форм иммунодефицита.

Недостаточность аденозиндезаминазы. АДА катализирует гидролитическое дезаминирование аденозина и дезоксиаденозина:

Аденозин + Н₂О → Инозин + NH₃,

Дезоксиаденозин + Н₂О → Дезоксиинозин + NH₃.

Фермент АДА обнаружен во многих органах и тканях, однако его недостаточность имеет наиболее тяжёлые последствия для клеток лимфоци-тарного ряда. Низкая активность этого фермента нарушает пролиферацию и созревание Т- и В-лимфоцитов и сопровождается тяжёлыми формами клеточного и гуморального иммунодефицита. Дети, страдающие этой патологией, как правило, погибают в раннем возрасте от бактериальных, вирусных или грибковых инфекций.

Столь тяжёлые последствия недостаточности АДА для клеток лимфоцитарного ряда объясняют тем, что при снижении скорости дезаминирования адениловых и дезоксиадениловых нук-леотидов в клетках увеличивается концентрация дАТФ, который ингибирует РНР. Это нарушает синтез всех дНТФ и лишает клетки субстратов для синтеза ДНК. Для нелимфоцитарных клеток недостаточность АДА не сопровождается нарушениями метаболизма в связи с тем, что в них активно работает фосфатаза дАТФ, которая предотвращает накопление основного ингибитора РНР - дАТФ.

Фермент обладает групповой субстратной специфичностью и использует в качестве субстратов некоторые производные аденозина, которые применяются в терапии онкологических и противовирусных заболеваний (аденозинарабинозид, формицин).

Недостаточность пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ). ПНФ катализирует фосфоролиз пуриновых рибо- и дезоксирибонуклеозидов с освобождением азотистых оснований и рибозо- или дезоксирибозо-1-фосфата. Субстратами служат гуанозин, дезоксигуанозин и инозин.

Нуклеозид + Н₃РО₄→ Азотистое основание + Рибозо-1-фосфат.

Фермент обнаружен во многих органах и тканях, но особенно активен в клетках-предшественниках Т-лимфоцитов в процессе их созревания в тимусе. При наследственной недостаточности пуриннуклеозидфосфорилазы, вызванной генными мутациями, в крови снижается образование и количество зрелых Т-лимфоцитов. Нарушение созревания Т-лимфоцитов вызвано тем, что в этих клетках высокой активностью обладает дезоксигуанозинкиназа, а это приводит к накоплению дГТФ в концентрациях, которые, подобно дАТФ, ингибируют РНР.

У детей снижен клеточный иммунитет, хотя гуморальный иммунитет не страдает, так как в В-лимфоцитах дезоксигуанозинкиназа малоактивна и накопления дГТФ в токсических концентрациях не отмечают.

Болезнь, вызванная недостаточностью ПНФ, характеризуется более лёгким течением, чем болезнь, обусловленная дефицитом АДА.